Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия). Поляризационная микроскопия Поляризованная микроскопия

Поляризационная микроскопия является одним из мощных методов морфологических исследования структуры и свойств препаратов. Поляризационная микроскопия позволяет изучать свойства гистологических структур, обладающих способностью двойного лучепреломления.

Для реализации метода поляризационной микроскопии можно дооснастить любой микроскоп. Микроскоп дооснащяется двумя поляризационными фильтрами: первый помещают непосредственно под конденсором, второй помещают между объективом и глазом исследователя. Поворотом поляризатора добиваются затемнения поля зрения. Помещают препарат. Вращают препарат на предметном столике до появления ярко светящихся структур. Свечение появляется в тот момент, когда ось двулучепреломляющего объекта будет находиться под углом 45° к плоскости поляризации.

Ранее для поляризационной микроскопии использовались поляризационные фильтры с линейной поляризацией. В новой методике изучалась возможности диагностики препаратов с использованием поляризационных фильтров с циркулярной поляризацией. Оказалось, что изображения, полученные с помощью циркулярных фильтров, несут гораздо больше информации и позволяют выявлять более тонкую структуру тканей и клеток.

Исследования в поляризованном свете можно проводить на замороженных или парафиновых срезах после депарафинизации, неокрашенных и окрашенных, заключенных в различные среды. Блоки ткани следует вырезать и ориентировать таким образом, чтобы мышечные волокна интересующего слоя миокарда были срезаны продольно.

Миофибриллы в поляризованном свете обнаруживают характерную поперечную исчерченность, связанную с чередованием, анизотропных (А) и изотропных I - дисков. Диски А обладают ярко выраженным положительным двулучепреломлением и кажутся светлыми в поляризованном свете (в обычном свете они темные), тогда как I - диски почти полностью лишены способности к двулучепреломлению и в поляризованном свете выглядят темными (в обычном свете - светлые).

С помощью поляризационной микроскопии удобно выявлять наиболее универсальные повреждения мышечных волокон миокарда и скелетных мышц - контрактурные повреждения (нарушение поперечной исчерченности кардиомиоцитов - одно из ранних признаков повреждения миофибрилл).

Принято выделять 3 стадии этих повреждений:

I стадия - усиливается анизотропия на отдельных участках мышечных волокон. II

стадия - А-диски с повышенной анизотропией сближаются, вследствие чего толщина 1-дисков уменьшается. III

стадия - А-диски сливаются в сплошной анизотропный конгломерат.

Наряду с контрактурными повреждениями поляризационная микроскопия

позволяет идентифицировать еще один тип поражения поперечнополосатых мышечных волокон - гиперрелаксацию саркомеров, свойственную в большой мере ишемии миокарда .

Простота поляризационного метода позволяет с минимальными затратами резко повысить достоверность диагностики наличия инфаркта миокарда.

По поводу поляризационного микроскопа. Ситуация состоит в том, что практически из любого микроскопа можно сделать поляризационный. Используются два поляризационных фильтра (покупаемых в фотомагазине) - один помещается над осветителем, а второй помещается между препаратом и объективом.

Создан справочный CD-ROM - «Поляризационная микроскопия». На диске собрано большое количество работ и материалов по применению поляризационной микроскопии.

Кроме того, создан специализированный комплекс - автоматизированное рабочее место судмедэксперта. В состав комплекса входят - микроскоп поляризационный Nikon E200, цифровая камера с 8 млн элементов, адаптеры и программное обеспечение.

Список литературы: 1.

Кактурский Л.В. Поляризационная микроскопия. В кн. Микроскопическая техника. - М.: Медицина, 1996. 2.

Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А. Применение поляризационной микроскопии для гистологической диагностики ранних стадий ишемических и метаболических повреждений миокарда // Cor et vasa. - 1977 - Vol. 19. - № 1. - P. 28-33 3.

Непомнящих Л.М. Морфогенез важнейших общепатологических процессов в сердце. - Новосибирск: Наука, 1991. - 352 с. 4.

Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М. Очаговые повреждения и инфаркт миокарда. Световая, поляризационная и электронная микроскопия. - Новосибирск, 1980.

Еще по теме Колтовой Н.А. НОВЫЙ МЕТОД ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА:

1. ВОПРОС 252: Какие недостатки в профессиональной деятельности медицинских работников могут стать поводом для возбуждения уголовного или гражданского дела?
2. Кирилов В.А., Бахметьев В.И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИДА ВНЕШНЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ РАЗРУШЕНИЯ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
3. Мишин Е.С., Подпоринова Е.Э., Праводелова А.О. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОДЪЯЗЫЧНОЙ КОСТИ, ГОРТАНИ И ТРАХЕИ ПРИ ТУПОЙ ТРАВМЕ ШЕИ

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Интерференционная микроскопия

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой - мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.

Люминесцентная микроскопия

Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.

Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.

Из всего многообразия устройств для микроскопии, поляризационные микроскопы являются самыми сложными в техническом плане. Такое внимание к конструкции прибора по части технологичности обусловлено необходимостью получать изображение высочайшего качества, на которое непосредственно влияют конструкция оптической и осветительной частей микроскопа. Основная область использования поляризационных устройств для микроскопии - это изучение минералов, кристаллов, шлаков, анизотропных объектов, текстильной и огнеупорной продукции, а также других материалов, для которых свойственно двойное лучепреломление. На последнем принципе и построено формирование изображения в таких устройствах для микроскопии, в которых исследуемый образец облучается поляризационными лучами. При этом, анизотропные свойства образцов проявляются после изменения направления луча. Для этих целей, в конструкции поляризационных микроскопов предусмотрены вращающиеся в различных плоскостях относительно друг друга поляфильтры: анализатор поворачивается на 180 градусов, а поляризатор - на 360. Основной особенностью устройств для микроскопии в поляризационном свете является возможность проводить ортоскопические и коноскопические исследования, недоступные при использовании большинства других типов микроскопов.

Исследование образца под поляризационным микроскопом начинается с установки поляризатора в осветительной части микроскопа под конденсор, рядом с апертурной диафрагмой. При этом, анализатор находится между окуляром и объективом - за последним по ходу лучей света. При правильной настройке такого прибора для микроскопии, после скрещивания поляфильтров, видимое поле будет равномерно темным, образуя, так называемый, эффект погашения. По завершении настроек устройства, исследуемый образец закрепляется на предметном столике и проводится его изучение. Столики поляризационных микроскопов центрируются относительно оптической оси и могут поворачиваются на 360 градусов, а в подобных устройствах для лабораторных и исследовательских целей, так же имеют нониус. Оптика и осветительная система поляризационных микроскопов высочайшего качества и такой точности изготовления, что позволяет получать максимально четкое изображение без искажений. Часто в комплект устройств для проведения исследований образцов в поляризационном свете входят компенсатор и линза Бертрана. Первая дает возможность эффективно исследовать структуру минералов, а линза - увеличивать и сосредотачивать область наблюдения при появлении изменений изображения после поворота предметного столика. Сегодня на рынке представлены три основных типа таких устройств для микроскопии - это уже упомянутые исследовательские и лабораторные, а также рабочий поляризационный микроскоп.

Метод фазово-контрастной микроскопии

Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)

Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой -- мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

Поляризационная микроскопия

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Е. Темнопольная микроскопия.

18. Микроскоп состоит из оптических и механических частей. Что относят к оптическим частям?

А. Тубус, окуляр, конденсор

В. Револьвер, макро- и микровинт, зеркало

С. Револьвер, окуляр

Д. Окуляр, конденсор, объектив

Е. Тубус, окуляр, револьвер

19. При использовании ультрафиолетовых лучей, как источник света, разрешающая способность микроскопа увеличивается. В каких микроскопических приборах используется данный источник света?

А. Темнопольный и люминесцентный

В.Люминесцентный, ультрафиолетовый

С. Световой и электронный

Д.Фазово-контрастный, ультрафиолетовый

Е.Поляризационный, ультрафиолетовый

20. Микроскоп состоит из механических и оптических частей. В каких деталях микроскопа есть диафрагма?

А. Окуляр и объектив

В. Окуляр и конденсор

С. Тубус и окуляр

Д. Объектив и конденсор

Е. Тубус, объектив, окуляр

21. В эксперименте использовались живые объекты, в которых необходимо определить ряд химических компонентов, используя витальное наблюдение. Какой микроскопический метод исследования будет использован?

А. Фазово-контрастная микроскопия

В. Электронная микроскопия

С. Флюоресцентная микроскопия

Е Темнопольная микроскопия.

22. При гистологическом исследовании клетки использовали люминофоры. Какой вид микроскопии использован в данном случае?

А. Световая микроскопия

В. Электронная микроскопия

С. Флюоресцентная микроскопия

Д. Поляризационная микроскопия

Е. Темнопольная микроскопия.

23. Перед исследователем поставлена задача получить пространственное представление о структурах изучаемого объекта. С каким микроскопическим прибором будет работать специалист?

А. Ультрафиолетовая микроскопия,

В. Фазово-контрастная микроскопия,

С. Просвечивающая электронная микроскопия,

Д. Сканирующая электронная микроскопия,

Е. Поляризационная микроскопия

24. В качестве источника света используются ртутно-кварцевые лампы. Какова разрешающая способность микроскопа при таком источнике света?

25. Разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны источника света. Какова разрешающая способность светового микроскопа?

26. Перед началом исследования гистологического препарата необходимо равномерно осветить поле зрения. Какие части микроскопа для этого используют?

А. Микро- и макровит

В. Конденсор и зеркало

С. Тубус и тубусодержатель

Д. Тубус и окуляр

27. Перед исследователем поставлена задача изучить ультра-микроскопическое строение плазмолеммы эритроцита. Какой микроскопический прибор будет использован?

А. Световой

В. Фазово-контрастный

С. Электронный

Д. Поляризационный

Е. Ультрафиолетовый

28. При изучении скелетной мышечной ткани необходимо определить изо- и анизотропные структуры ткани. Какой вид микроскопии будет использован?

А. Световой

В. Фазово-контрастный

С. Электронный

Д. Поляризационный

Е. Ультрамикроскопический

29. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа зависит от длины волны источника света. Чему она равна?

А. 0,1 мкм С. 0,4 мкм

В. 0,2 мкм Д. 0,1 нм

30. В клинической лаборатории для изучения общего анализа крови используются микроскопические исследования. Какой микроскоп необходим для этого?

А. Световой,

В. Фазово-контрастный,

С. Электронный,

Д. Поляризационный,

Е. Ультрафиолетовый.

31. Для исследования представлен живой объект, обладающий природной люминесценцией. Какой вид микроскопии необходимо использовать при данном исследовании?

А. Световой

В. Фазово-контрастный

С. Электронный

Д. Поляризационный

Е. Ультрафиолетовый

32. В результате биопсии получен материал опухолевых клеток. Необходимо изучить их ультрамикроскопическое строение. Какой вид микроскопии используют при данном исследовании?

А. Световой

В. Фазово-контрастный

С. Электронный

Д. Поляризационный

Е. Ультрафиолетовый

ТЕМА 2: ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА

Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях.

Микроскопическая техника.

Главные этапы цитологического и гистологического анализа:

Выбор объекта исследования

Подготовка его для изучения в микроскопе

Применение методов микроскопирования

Качественный и количественный анализ полученных изображений

Методы, применяемые в гистологической технике:

1. Прижизненные.

2. Посмертные.

I ПРИЖИЗНЕННЫЕ МЕТОДЫ

Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов.

Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo).

А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) –

Метод культивирования

Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные.

Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать.

Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др.

Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.

Недостатки метода:

1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку.

2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании).

3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.

Похожая информация.