Полимеразная цепная реакция, ее сущность и области применения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод высокой точности обнаружения конкретных возбудителей инфекций Полимеразная цепная реакция пцр диагностика

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2. Принцип метода полимеразной цепной реакции

2.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов

2.2 Циклический температурный режим

2.3 Основные принципы подбора праймеров

2.4 Эффект "плато"

3. Cтадии постановки ПЦР

3.2 Амплификация

3.4.1 Положительные контроли

3.4.2 Внутренние контроли

4.1 Качественный анализ

4.1.2 Детекция молекул РНК

3.1 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

3.2 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

3.3 Оценка результатов реакции

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

3.3.1 Метод горизонтального электрофореза

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Однако это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.

3.3.2 Метод вертикального электрофореза

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламидные гели. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в обычной работе используют метод горизонтального электрофореза.

3.4 Контроль за прохождением реакции амплификации

3.4.1 Положительные контроли

В качестве "положительного контроля" используют препарат ДНК искомого микроорганизма. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Размер неспецифических продуктов может быть как большего, так и меньшего размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды (участки ДНК, расположенные внутри амплифицируемой последовательности), меченные ферментными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры. Это значительно усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость существенно увеличивается.

3.4.2 Внутренние контроли

Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели используют дополнительный, так называемый "внутренний контроль". Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов. Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.

К сожалению, несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с внутренним контролем за праймеры. Это особенно принципиально важно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце, что может приводить к ложноотрицательным результатам.

Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры, этот способ контроля эффективности амплификации безусловно будет весьма полезен.

4. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

4.1 Качественный анализ

Классический способ постановки ПЦР, принципы которого были изложены выше, нашел свое развитие в некоторых модификациях, направленных на преодоление ограничений ПЦР и повышение эффективности прохождения реакции.

4.1.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"

Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Существуют различные варианты реализации "горячего старта":

Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение ингредиентов реакционной смеси парафиновой прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются при расплавлении парафина (~65-75 0 С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных случаях, даже если неспецифический отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

4.1.2 Детекция молекул РНК

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются попытки обойти этот недостаток используя в качестве обратной транскриптазы термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn 2+ . Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси также как и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции обратной транскрипции полученные молекулы кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

5. Организация технологического процесса постановки ПЦР

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода - контаминацией.

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные результаты.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на урацил, и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Таким образом, этот метод лишь в некоторой степени позволяет устранить источник контаминации и не гарантирует от ложноположительных результатов.

Другой способ борьбы с результатами контаминации, значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных результатов велик, т.к и в этом случае при отсутствии ингибиторов легко получить продукт амплификации из-за контаминации.

Таким образом, несмотря на пользу преамплификационных мероприятий, направленных на инактивацию молекул ДНК, служащих причиной возникновения ложноположительных результатов, наиболее радикальным средством является заранее продуманная организация лаборатории.

Заключение

Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

Полимеразная цепная реакция известна уже 30 лет. Ее широко используют во многих областях, начиная с археологии и заканчивая генетикой.

Именно метод пцр помогает установить отцовство, но наиболее часто его используют для выявления различных инфекционных болезней в организме человека.

Как проводят анализ методом пцр, и что это такое? На эти вопросы мы постараемся детально ответить.

Анализ ПЦР - что это такое?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.

Метод ПЦР - абсолютно специфичен и выполненный правильно не может дать ложноположительный результат. То есть, если инфекции нет, то анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому сейчас очень часто для утверждения диагноза дополнительно сдают анализ ПЦР, чтобы определить возбудителя и его природу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 1983 году разработал Кэри Мюллис (США), за что в 1993 году он удостоен Нобелевской премии в области химии.

В чем преимущество данного метода?

Диагностика этим методом позволяет найти возбудителя непосредственно в гене, который содержится в исследуемых материалах. Это самый точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции, различные венерические заболевания.

Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем:

• метод нацелен на выявление самого возбудителя;
• диагностика методом ПЦР отличается универсальностью: для обнаружения возбудителей нескольких;
• заболеваний достаточно только одного биологического образца больного;
• метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями.

Кроме этого, преимуществом ПЦР-диагностики является то, что для анализа пригоден любой биологический материал пациента: кровь, выделения из половых органов, моча, сперма.

Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?

В организме может присутствовать большое количество возбудителей инфекций, сюда относятся и «скрытые», которые длительное время никак себя не проявляют.

Анализ мазка на ПЦР позволяет выявить такие инфекции :

• уреплазмоз половых органов;
• кандидоз ();
• герпес;
• наличие раковых клеток;
• оценить гормональное состояние;

Исследуемым материалом для ПЦР обычно являются мокрота, слюна, моча, кровь. Перед проведением анализа необходимо тщательно подготовиться к нему, получив предварительную консультацию у врача.

Кровь для ПЦР обычно сдается натощак. Хорошие результаты показывает проведение анализа, когда материал для исследования взят из цервикального канала или уретры. В этом случае лучше всего провести ПЦР-диагностику не позже, чем через сутки после полового акта.

Разновидности ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. Существуют разные методики проведения анализа:

1. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК.
2. Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
3. Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции.
4. Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа.
5. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени - используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции.
6. Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) - с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров.
7. Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) - ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н - А, Т или С.

Какие биологические материалы исследуются?

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека:

1. Моча . Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
2. Мокрота . Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
3. Биологические жидкости . Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
4. Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек . Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
5. Биоптаты . Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.
6. Кровь, плазма, сыворотка . Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.

Как подготовиться к сдаче анализа?

Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования:

1. Моча сдается утром в стерильный контейнер.
2. Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время.
3. Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.

Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день.

Расшифровка анализа ПРЦ

Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой. Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать:

• Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель.
• Пцр положительный обозначает, что в организме человека присутствует ДНК или РНК возбудителя.

В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве.

Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.

Насколько точна ПЦР диагностика инфекций?

Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен:

• точно определить наличие или отсутствие инфекции;
• точно указать, что именно это за инфекция (специфичность);
• обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале,
• который был подвергнут исследованию (чувствительность).

ПЦР анализ: цена и сроки

Цена конкретного анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию вы будете проверяться. Примерные цены и сроки:

1. ИППП: 300-500 руб, сроки – 1 день;
2. Вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы человека, герпеса, цитомегаловирус: 300-500 руб, сроки – 1 день;
3. Гепатит A, B, C, D, G: качественный анализ 650 руб, количественный анализ 2000 руб. Сроки – до 5 дней;
4. Антитела к вирусу гепатита С, суммарные (Anti-HCV) – 420 руб;
5. Антитела к вирусу гепатита C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 руб;
6. Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori): 300-400 руб, сроки – 1 день;
7. ВИЧ (антитела и антигены) – 380 руб;
8. РНК ВИЧ, качественно – 3 500 руб;
9. РНК ВИЧ, количественно – 11 000 руб.

Чтобы сэкономить средства, можно выбирать фиксированный пакет анализов. Такую услугу предоставляет большинство клиник где можно сдать анализ методом ПРЦ (инвитро, онклиник и т.д).

Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей)

Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур , создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых блоках- коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК)

Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента)
Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40) циклов.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах 1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°C в течение 30-40 сек. 2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существет своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига -20-60 сек. 3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). (см.рис.2). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

СТАДИИ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР - АНАЛИЗА

В основе метода ПЦР, как инструмента лабораторной диагностики инфекционных заболеваний лежит обнаружение небольшого фрагмента ДНК возбудителя (несколько сот пар оснований), специфичного только для данного микроорганизма, с использованием полимеразной цепной реакции для накопления искомого фрагмента.
Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:

1. Выделение ДНК (РНК) из клинического образца

Выделение ДНК (РНК)
На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций , и получение раствора ДНК или РНК, свободной от
ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.
Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

Амплификация специфических фрагментов ДНК
На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется т.н. “классический вариант направленной ПЦР. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используется метод “гнездной” (nested) ПЦР, в котором используются 2 пары праймеров (“внешние” - для 1 стадии, и “внутренние” - для 2-ой стадии).

Детекция продуктов амплификации
В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется (образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды") со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. В НПФ "Литех" созданы наборы для детекции на основе гибридизации с флуориметрической регистрацией результатов

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

- Прямое определение наличия возбудителей

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся прдуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

- Высокая скорость полученоя результата анализа
Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.

Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В ПРАКТИЧЕСКОМ ЗДРАВООХРАНЕНИИ

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в:

урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции;

в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза;

в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза;

в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В,С и G;

в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Принципы ПЦР-диагностики

РЕФЕРАТ

разделов, 34 страницы, 5 рисунков, 5 литературных источников

Цель данной работы - краткое изложение основных принципов и технологических особенностей метода ПЦР, его научного и практического применения в диагностике инфекционных заболеваний.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВГС - вирус гепатита С

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

дЦТФ - дезоксицитозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота- иммуноглобулин класса GTime PCR - метод ПЦР в режиме реального времени

ВВЕДЕНИЕ

ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

СТАДИИ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АНАЛИЗА

МЕТОД ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (Real-Time PCR)

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР

ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА ПЦР

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэрри Мюллисом в 1983 году. За разработку ПЦР-анализа К.Мюллис в 1993 году был удостоен Нобелевской премии в области химии.

После открытия ПЦР она была очень быстро внедрена в практику. Метод стал настолько популярен, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п.н.) требовалась неделя, то современные лазерные секвенаторы позволяют определять до 5000 п.н. в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки возможных применений метода.

Появление метода ПЦР было обусловлено определенными достижениями в области молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. Следует отметить, что этому открытию сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95°С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии, молекулярной генетики и клинической лабораторной диагностики, позволяющим выявлять в тканях и биологических жидкостях организма единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний.

В основе метода ПЦР лежит комплиментарное достраивание участка геномной ДНК или РНК возбудителя, осуществляемое in vitrо с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. Специфичность метода определяется уникальностью генетического материала выявляемых инфекционных агентов, к которому подобраны олигонуклеотидные праймеры, участвующие в процессе амплификации.

Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных трудно культивируемыми агентами, генотипирование микроорганизмов, оценка их вирулентности, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальная диагностика, биологический контроль препаратов крови - вот неполный перечень направлений медицины с применением ПЦР. На сегодняшний день ПЦР-анализ остается наиболее распространенной и динамично развивающейся технологией. Ежегодно на рынке появляются десятки новых тест-систем для ПЦР-анализа, предназначенных как для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов - возбудителей заболеваний, так и для исследования генов человека. Себестоимость ПЦР-анализа неуклонно снижается, что способствует все более широкому использованию метода в лечебных и диагностических учреждениях. Количество ПЦР-лабораторий в странах СНГ растет в геометрической прогрессии и, видимо, в ближайшее время ПЦР-анализ станет одним из самых распространенных методов лабораторной диагностики.

1. ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

Полимеразная цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей).

Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermisaquaticus , оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для их идентификации.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.

. СТАДИИ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-АНАЛИЗА

Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:

1. Выделение ДНК (РНК) из клинического образца;

2. Амплификация специфических фрагментов ДНК;

. Детекция продуктов амплификации.

. Выделение ДНК (РНК)

На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

2.Амплификация специфических фрагментов ДНК

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:

·Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

·Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплиментарности.

·Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) - «строительный материал», используемый Taq- полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

·Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

·Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования.

Рис.1 Компоненты реакционной смеси

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режима:

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°C в течение 30-40 сек.

Одна из цепей (+) используется в качестве основной матрицы. Ее пять штрих-концов фиксируются ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплиментарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, поскольку расплетение молекулы ДНК идет в обратном порядке, новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплиментарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагают в интервале 50-65°С. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная температура отжига праймеров - одна из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплиментарным последовательностям.

Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого.

Время отжига -20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК (элонгация).

Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках (коротких двунитевых участках). Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой олигонуклеотиды длиной около 20 п.н., также называемые праймерами. Они комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними.

Комплементарное достраивание цепей ДНК идет в направлении от 5`-конца к 3`-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона) и т.д.

Рис.2 Принцип амплификации ДНК

В настоящее время применяется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, точнее, природой его клеточной стенки. Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная В.R.Marmionetal. (1993). Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R.Boometal. (1990), основанный на использовании для лизиса клеток сильного лизирующего агента - гуанидинатиоционата (GuSCN) и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК.

При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex (США), которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых способов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время использование подобных методов для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам вследствие применения в реакционной смеси некачественного препарата ДНК. Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Во время следующей процедуры - амплификации - образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, два вида праймеров, два энзима (Таg-полимераза и N-урацил-гликолаза) и четыре вида нуклеотида A, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство (термоциклер или ДНК-амплификатор), позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. В первом цикле осуществления ПЦР образец нагревается до температуры 94°С для разделения двух комплиментарных нитей ДНК. Затем температура снижается до 40-60°С, при которой праймеры присоединяются к единичной цепи ДНК, после чего температура вновь поднимается до 72°С, когда наиболее выражена активность полимеразы. Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут.

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день - электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, например бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).

В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

«Положительный контроль» позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма.

Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.

Несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Так, если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с «внутренним контролем» за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в исследуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен.

Рис.3 Второй цикл амплификации ДНК

. Детекция продуктов амплификации

). Метод горизонтального электрофореза

Одним из методов визуализации результатов амплификации является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле. Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.

Рис.4 Детекция продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза

). Метод вертикального электрофореза

Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют.

3). Метод гибридизационных зондов

В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется (образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды") со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически.

3. МЕТОД ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (Real-Time PCR)

Метод Real-Time PCR позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа Real-Time PCR.

Кинетическая кривая в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет S-образную форму.

В ней можно выделить три стадии:

1.Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).

2.Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР).

.Плато (стадию насыщения).

Рис.5 График кинетической кривой флуоресценции методом Real-Time PCR

Регистрация флуоресцентного сигнала проводится в процессе амплификации на специальном приборе - амплификаторе для Real-Time PCR. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК.

Преимущества метода ПЦР в режиме реального времени

nвозможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации;

nпринципиальным преимуществом является возможность осуществления детекции накопления ампликонов без открытия пробирки, что минимизирует риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации проб и реагентов продуктами амплификации;

nсущественное уменьшение количества манипуляций с исследуемым образцом сокращает затраты времени, упрощает анализ и позволяет снизить вероятность ошибок;

nподобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации;

nснижение требований, предъявляемых к ПЦР лаборатории;

nувеличение объективность интерпретации результатов ПЦР-исследования, поскольку обработка ведется с помощью программного обеспечения прибора;

nзначительно, практически в два раза, сокращается общее время исследования позволяя получить результат уже через 1.5 - 2 часа после поступления клинического материала в лабораторию;

nданный метод впервые позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК микроорганизма в клинической пробе;

nприменение наряду с праймерами гибридизационных зондов обеспечивает повышение специфичности анализа;

nвозможность независимой одновременной регистрации флуоресцентного сигнала от нескольких гибридизационных ДНК-зондов допускает выявление в одном исследовании нескольких различных участков одной или различных ДНК-мишеней.

. ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР

nНепосредственное определение возбудителей инфекционных заболеваний

Метод ПЦР дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического фрагмента ДНК возбудителя.

nВысокая специфичность ПЦР

Методом ПЦР в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК присущий только конкретному возбудителю - бактерии или вирусу. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

nВысокая чувствительность ПЦР

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).

nУниверсальность ПЦР

Поскольку возбудитель может содержаться в любых биологических выделениях и тканях при ПЦР-исследовании может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами - слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток.

nВысокая скорость получения результата ПЦР-анализа

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.

nВозможность диагностики любого вида инфекции

Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет диагностировать инфекцию не только на острой стадии заболевания, но и хронические инфекции и даже наличие единичных бактерий или вирусов.

В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:

Более высокая частота обнаружения микроба, превышающая аналогичный показатель при использовании культурального метода, на 6-7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма.

Время, необходимое для обнаружения возбудителя культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4-5 часов.

Использование технологии ПЦР позволяет проводить определение возбудителей, например хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

nВозможность проведения мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях.

nВозможность выявления отдельных субтипов и штаммов вирусов и бактерий.

nВозможность определения нескольких видов возбудителей (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonasvaginalis, Ureaplasmaurealyticum) из одной пробирки с биологическим материалом.

Данный метод сравним по трудоемкости с классическими методами (иммуноферментным, иммунофлуоресцентным и т.п.), но дает более достоверную диагностическую информацию, позволяя непосредственно обнаруживать ДНК или РНК инфекционного агента в клиническом материале. Поэтому метод ПЦР, наравне с культуральным методом, признается «золотым стандартом» для диагностики инфекционных заболеваний.

5. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА ПЦР

·В ходе реакции амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма

·Возможность перекрестной реакции

Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме данного и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа.

·Изменчивость микроорганизмов

Хотя при конструировании тест-системы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высоко консервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой.

Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок.

6. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР

полимеразный диагностика инфекционный заболевание

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах:

1. криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев.

2. установление отцовства

При анализе результатов электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР отец-ребенок-мать обнаруживается, что ребенок унаследует некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дает уникальный отпечаток. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

3. медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

4. клонирование генов

Клонирование генов - это процесс выделения генов и, в результате генно-инженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

5. секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

6. мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

7. диагностика инфекционных заболеваний

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

8. диагностика вирусных заболеваний

Наиболее всесторонние преимущества ПЦР при диагностике вирусных заболеваний можно продемонстрировать, рассматривая инфекционный процесс, обусловленный вирусом гепатита С (ВГС). Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения этого вируса представляет по следующим причинам:

) отсутствие способа культивирования ВГС; 2) наборы для антигенной диагностики не существуют; 3) реакция образования антител к ВГС настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, поставить невозможно.

Поэтому в настоящее время становится общепризнанным использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной ВГС.

При этом только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи: 1) проводить диагностику острой инфекции при позднем выявлении антител к ВГС; 2) осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита С у иммуносупрессированных пациентов; 3) оценивать эффективность противовирусной терапии; 4) выявлять виремию у доноров крови с нормальным уровнем аминотрансфераз; 5) определять возможную контаминацию препаратов крови; 6) оценивать широту распространения ВГС.

9. применение ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии

Частой причиной атипичных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов являются микоплазмы и хламидии. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя (С. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Использование метода ПЦР позволяет значительно улучшить раннюю диагностику туберкулеза. В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к антибиотикам.

10. применение ПЦР в практике службы крови

Обследование донорской крови на гепатиты, сифилис, ВИЧ серологическим методами не исключает опасности использования инфицированной крови из-за наличия у этих заболеваний определенного серонегативного периода, который может составлять до нескольких недель с момента появления возбудителя в крови. Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР.

11. применение ПЦР в неонатологии

Целый ряд микроорганизмов способны поражать плод во время беременности. Это цитомегаловирус, токсоплазмы, вирус герпеса, вирус краснухи, микоплазмы, хламидии и др. Использование серологических тестов для определения этих инфекций у новорожденных неэффективно, поскольку формирование иммунной системы у ребенка происходит в течение нескольких месяцев, и наличие инфекционного агента может не сопровождаться выработкой специфических антител. С другой стороны, в крови новорожденного длительное время могут присутствовать материнские антитела класса IgG, способные проникать через плацентарный барьер. Таким образом, наличие специфических IgG у ребенка в первые месяцы жизни не свидетельствует о присутствии возбудителя. Применение ПЦР-анализа значительно увеличивает возможности диагностики неонатальных инфекций, в том числе и на внутриутробном этапе.

12. применение ПЦР в урогинекологической практике

Среди инфекционных агентов, поражающих урогенитальный тракт в последнее время большое внимание уделяется возбудителям латентных и хронических инфекций - хламидиям, микоплазмам. Для заболеваний, вызываемых этими возбудителями, характерна стертость клинической симптоматики, хроническое течение, часто приводящее к поражению репродуктивных функций - невынашиванию беременности, бесплодию. Многочисленные исследования по изучению применения метода ПЦР для выявления Сhlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, проведенные в крупных клиниках разных странах, показали высокую эффективность данного метода. Признано, что по показателям чувствительности и оперативности ПЦР превосходит культуральный метод, принятый в качестве "золотого стандарта".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, технология ПЦР - мощный инструмент, обеспечивающий возможность изучения и диагностики хронических инфекционных процессов, экологии возбудителей инфекционных заболеваний. Метод ПЦР-диагностики дополняет уже существующие приемы микробиологической диагностики, качественно меняет методологию решения прикладных проблем медицинской микробиологии и эпидемиологии.

Учитывая вышесказанное, сформулируем направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль.

Диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Это наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях.

ПЦР - наиболее эффективный метод для выявления и изучения возбудителей, которые, находясь в «некультивируемом» состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия.

ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий.

Перспективными направлениями практического использования ПЦР-диагностики являются:

· диагностика онкологических заболеваний;

· диагностика лейкемий и лимфом;

· диагностика рака молочной железы;

· диагностика других злокачественных заболеваний;

ДНК-диагностика доброкачественных и злокачественных новообразований ограничивается небольшим, но все возрастающим числом сведений о генах, ассоциированных с этими заболеваниями;

· диагностика генетических заболеваний.

Диагностика генетических заболеваний может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностирования и начала лечения болезни до появления ее симптомов;

· идентификация личности: судебная медицина, криминалистика; трансплантация органов и тканей; определение отцовства. Эксперты оценивают это направление на рынке ДНК-диагностикумов как одно из наиболее крупных и быстрорастущих;

Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии. В настоящий момент полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики .

Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?

Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

В чем суть и механика ПЦР диагностики?

ПЦР диагностика – генетическое исследование биоматериала.

Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа.

Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:
Г - Ц
Т - А
А - Т
Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

Помимо ДНК такую же структуру имеет РНК – рибонуклеиновая кислота, отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил. РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами (например, ВИЧ).

Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку. Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент -«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» - последовательности из 5-15 нуклеотидов. Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии , микоплазмы , вирусов) экспериментально.

Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем». В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

Этапы проведения ПЦР исследования

Забор биологического материала для исследования

В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее.

Этапы непостредственно ПЦР реакции, копирование генетического материала

I

«Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».
Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии , «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

III этап - Копирование генетического материала возбудителя инфекции.
Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

Этап идентификации размноженного генетического материала

На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного.
Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.

ПЦР в диагностике инфекций
Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.
Основные области применения ПЦР-диагностики:

1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
2. контроль эффективности проведенной терапии
3. уточнение вида возбудителя

Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

Вирусы:

1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
2. герпетиформные вирусы
3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов