МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БЕШЕНСТВА

1. Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и главным образом - на основании лабораторных исследований.

2. Для исследования направляют в лабораторию с нарочным: свежий труп или голову от собаки (кошки, лисицы, песца, овцы, теленка и др.), от крупных животных - голову или головной мозг (свежий или консервированный в 30 - 50 %-ном растворе глицерина). Для серологических исследований пригоден только неконсервированный мозг.

3. Лабораторная диагностика бешенства заключается в микроскопическом исследовании головного мозга (с целью обнаружения телец Бабеша-Негри), серологическом (обнаружение специфического рабического антигена), а также в постановке биологической пробы на белых мышах или кроликах.

Порядок исследований.

4. Из головного мозга, поступившего для исследования, делают сначала засев на питательные среды. Часть мозга сразу же помещают в холодильник и сохраняют на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Примечание . Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы проводят в стерильных условиях при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток: хирургическими и анатомическими; для защиты глаз надевают очки, а нос и рот закрывают марлевой повязкой).

I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

5. Для микроскопического исследования делают отпечатки и мазки из разных участков головного мозга.

6. Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4 - 6 слоев. К поверхности среза несколько раз (3 - 4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

7. Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле.

Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

8. Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов:

а) окраска по Муромцеву. Изготовленные, еще влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте или в смеси спирта пополам с эфиром или ацетоном (химически чистым) в течение 1 - 2 ч и после этого промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После промывания водой влажные мазки помещают на 5 - 10 мин в раствор краски Мансона, разведенной водой 1:40. Затем краску сливают и тут же мазки погружают в 10 %-ный водный раствор танина на 8 - 10 мин до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом й снова высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри - в бледно-фиолетовый с темными включениями;

б) окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный отпечаток или мазок наносят на 4 - с смесь реактива «А» (метиленовый синий - 2 г, метиловый спирт без ацетона - 100 мл) и реактива «Б» (основной фуксин - 0,5 г, этиловый спирт без следов ацетона - 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива «А», 2 - 4 мл реактива «Б» и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают. В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой телец;

в) окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5 - 10 мин, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30 - 40 мин краской Гимза (1 - 2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и подвергают исследованию. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо прополаскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. При преобладании синего тона мазок снова обмывают подкисленным спиртом и промывают водой. Пирамидальные нервные клетки имеют синеватый цвет с интенсивно черным ядром, а тельца Бабеша-Негри - розово-красный с точечными включениями темно-синего цвета;

г) окраска по Борману-Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 мин фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) - 98 мл, ледяной уксусной кислоты - 2 мл; после фиксации их погружают на 5 мин в 10 % -ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе. Зафиксированные мазки в течение 2 мин окрашивают краской, приготовленной перед ее употреблением (насыщенного водного раствора метиленовой сини - 3 капли, насыщенного основного раствора фуксина - 2 капли, водопроводной воды - 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, фиксируют над пламенем горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток окрашивается в красновато-синий цвет, а их ядра - в темно-синий, тельца Бабеша-Негри окрашиваются в землянично-красный цвет с типично гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

II. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

9. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Реакция применяется для обнаружения специфического рабического антигена в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставилась биопроба. Для реакции можно использовать несвежий (до 1 мес.) головной мозг.

Реакцию выполняют на предметных обезжиренных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60 °С агарового геля, приготовленного по прописи: сухой агар-агар - 12 - 15 г; химически чистый хлористый натрий - 8,6 г; 1 %-ный раствор (фильтрованный) метилоранжа на 50°-ном спирте - 5 - 10 мл; мертиолят - 0,01 г; вода дистиллированная - 1 л.

Примечание . Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется, фильтрование среды не требуется. Другие сорта агар-агара требуют тщательной фильтрации.

После застывания агара в нем делают лунки с помощью тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4 - 5 мм, располагая их согласно трафарету (см. рис. - ).

Для реакции у крупных животных используют кусочки головного мозга - аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; у крыс, сусликов, морских свинок, хомяков и др. - три каких-либо отдела мозга; у мышей - весь головной мозг.

Схема постановки микропреципитации:
А - кора (левое полушарие); В - кора (правое полушарие); С - аммонов рог (левый);
Д - аммонов рог (правый); Е - мозжечок; Ж - продолговатый мозг;
1 , 2 , 3 , 4 - разведений глобулина, соответственно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Положительная РП со всеми разведениями глобулина
(кора головного мозга овцы, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:4; 1:8, 1:16
(аммонов рог собаки, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:16,
отсутствуют линии преципитации с разведениями 1:2, 1:4,
(продолговатый мозг собаки, уличное бешенство)

Мозг растирают в фарфоровой ступке пестиком или в самой черепной коробке в «пасту», которой заполняют луночки для антигена. Остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Объем используемых ингредиентов составляет 0,02 мл.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) и ставят в термостат на 6 ч при температуре 37 - 38 °С. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 ч после ее постановки. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату.

При положительной реакции преципитации в агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образовываться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации. Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

10. Реакция иммунофлуоресценции. Основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого головного мозга. Отпечатки готовят из кусочков головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) так же, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля аналогично делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при температуре не выше 4 °С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном наносят на препараты несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашку Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20 - 30 мин при температуре 25 °С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2 - 7,4) в течение 1 ч, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и подвергают исследованию. Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло.

В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15 - 20 мкм в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечается.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением различной величины. В контроле подобных образований не должно быть.

При отсутствии положительной флуоресценции ставят биологическую пробу.

III. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА

11. Биологическую пробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша-Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений. Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах.

12. Опытных мышей или кроликов заражают 10 %-ной суспензией из исследуемого мозга на физиологическом растворе или мясопептонном бульоне с pH 7,2 - 7,4. Для приготовления суспензии используются те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга собирают в стерильную пробирку и взвешивают, а затем тщательно растирают в ступке пестиком, после чего добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10 %-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и для заражения используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и к ней добавляют по 500 - 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл жидкости, после чего отстаивают еще 30 мин при комнатной температуре и затем используют для заражения. Суспензию необходимо готовить в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Биологическая проба на белых мышах . Для заражения используют белых мышей массой 8 - 10 г. Для каждого исследования берут 6 мышей, из которых 3 заражают в головной мозг, а 3 - подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Место заражения протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Для предупреждения глубокого проникновения иглы в мозг на ее кончик надевают ограничитель - небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2 - 3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 30 сут. При положительном результате биологической пробы у мышей обычно на 7 - 15-й день после заражения развивается клиника паралитического бешенства.

Вначале отмечаются вялость, взъерошенность шерсти и своеобразная горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее - передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2 - 3 сут.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют при помощи эфирного или хлороформенного наркоза. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

При отсутствии клинических проявлений бешенства у зараженных мышей в течение 30 сут их уничтожают. Банки, в которых они содержались, тщательно дезинфицируют.

Биологическая проба на кроликах . Для постановки биологической пробы берут 4 кроликов массой не менее 1,5 кг каждый. 2 кроликов заражают в мозг и 2 внутримышечно в области бедра. Суспензию вводят интрацеребрально в дозе 0,2 мл, а внутримышечно - в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают в течение 16 - 21 дня. Заболевание бешенством протекает у кроликов в тихой паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдение за кроликами ведут в течение 45 - 50 сут. По истечении указанного срока кроликов уничтожают. Клетки, в которых содержались подопытные животные, дезинфицируют.

IV. ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 1

1 Гистологическое исследование используют в качестве дополнительного метода

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и фиксируют в одной или двух порциях ацетона так, чтобы продолжительность фиксации была в пределах 6 - 18 ч.

Лучше фиксацию в ацетоне оставлять на ночь. Затем патматериал проводят через две порции ксилола, выдерживая по 30 мин в каждой, и через две порции парафина - по 1 ч в каждой. Готовые срезы депарафинируют обычным методом и окрашивают по Ленцу или Туревичу:

Окраска по Ленцу. Срезы окрашивают раствором эозина 1 - 3 мин (0,5 г эозина растворяют в 100 мл 60°-ного этилового спирта). Эозин быстро смывают водой и в течение 1 мин окрашивают метиленовой синькой Лефлера, промывают водой, осторожно подсушивают фильтровальной бумагой и дифференцируют раствором ед. кого натра в абсолютном спирте (5 капель едкого натра на 30 мл спирта) до бледно-розового цвета. На препарат наливают раствор уксусной кислоты (1 капля ледяной уксусной кислоты на 60 мл абсолютного спирта) и держат до появления слабо-синей окраски, быстро смывают спиртом и просветляют ксилолом в течение 4 - 5 мин. Тельца Бабеша-Негри окрашиваются в ярко-красный цвет с синими включениями, цитоплазма ганглиозных клеток - в бледно-голубой;

Окраска по Туревичу. Депарафинированные срезы сразу после проводки через спирты и дистиллированную воду окрашивают гематоксилином Вейгерта или Эрлиха, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1 %-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки обрабатывают смесью (в равных частях) насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (на 1 л горячей дистиллированной воды 25 - 30 г пикриновой кислоты) и 96°-ного спирта. При обработке наблюдают отхождение облачков красной краски, и срезы через 10 - 20 с приобретают желтый оттенок. Срезы быстро прополаскивают в воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой. Затем так же быстро проводят через абсолютный или 96°-ный спирт, карбол-ксилол, чистый ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри - вишнево-красного цвета, ядра клеток - черные или синие в зависимости от того, каким гематоксилином они окрашены. По форме и величине тельца Бабеша-Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша-Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозге здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции.

Для бешенства также характерны признаки острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт.

В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принимающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название «узелка бешенства» - на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка (1).

Вызываемое вирусом бешенства. При том не только для самого питомца, но и для его окружения (владельца и остальных членов семьи). Вирус вызывает воспаление головного мозга у человека и животных. Особенно восприимчивы к заболеванию лисицы, волки, кошки, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, овцы, козы, лошади и др. Домашние животные и человек заражаются при укусе больного бешенством животного или от попадания слюны на поврежденный участок кожи, слизистые оболочки или в глаза. Слюна может стать заразной за 10 суток до появления признаков бешенства.
В настоящее время существуют описания других путей передачи: воздушно-капельный способ (алиментарный - через пищу и воду) и трансплацентарный способ (через плаценту в период беременности).
Вирус, распространяясь по нервным путям, достигает слюнных желёз и нервных клеток коры головного мозга и, поражая их, вызывает тяжёлые необратимые нарушения.

Заболевание бешенством животных регистрируют на всем земном шаре (исключением являются лишь Япония, Австралия и Великобритания).

К сожалению, Россия не входит в список исключений. Москва и Московская область также являются благоприятной средой для возникновения заболеваний бешенством у домашних и диких животных.
Вирус нестоек во внешней среде - погибает при нагревании до 56 градусов за 15 минут, а при кипячении за 2 минуты. Вирус бешенства также чувствителен к ультрафиолетовым и прямым солнечным лучам. Однако, вирус бешенства устойчив к низким температурам и антибиотикам.

Инкубационный период во время заражения бешенством может длиться от нескольких суток до нескольких месяцев (в среднем 3-6 недель). Бешенство у человека может протекать даже до года. Проявлению клинической картины предшествует скрытый (инкубационный) период. Животное в это время также опасно.

Симптомы и признаки бешенства у животных

Признаки заболевания бешенством могут появиться у животного спустя пару недель после укуса бешеного животного или контакта с вирусом. Обращайте внимание на поведение питомца. Любое неадекватное и неестественное поведение животного должно вас насторожить и быть более наблюдательными. В некоторых случаях может повыситься температура.
Как известно, дикие животные боятся человека. В случае заболевания дикие звери могут приближаться к дому и даже нападать на домашний скот и людей. Поэтому, если ваш питомец начал вести себя агрессивно или чрезмерно ласково, то это серьезный звоночек, чтобы не рисковать и вызвать ветеринарного специалиста для обследования и диагностики на вероятность заболевания бешенством.

Часто неспецифичная симптоматика и ненадежная прижизненная диагностика должны исключать варианты «на авось», т.к. речь идет о летальных последствиях не только для питомца, но и с большой вероятностью для владельца.

Диагностика бешенства у животных

Диагноз ставится на основе комплексных данных и лабораторных анализов. 100% надежного способа прижизненной диагностики бешенства у животных, применяемых в ветеринарной практике, на сегодняшний день не существует.
Прижизненно вирусный антиген может быть выявлен с помощью МФА в отпечатках роговицы больных бешенством животных. А также, вирус может быть выделен из некоторых тканей и жидкостей организма. Но все же отрицательный результат данного метода не исключает все таки возможность заражения бешенством.
При посмертной диагностики бешенства у животных результаты точнее, т.к. применяются другие методы. Например, одним из точных патологоанатомических диагнозов при исследовании головного мозга является обнаружение специфических включений (телец Бабеша-Негри). Также важнейшим методом остается биопроба - интрацеребральное заражение.
Препятствием для диагностирования бешенства у животных является также наличие различных форм протекания заболевания. Ветеринарные врачи условно поделили проявление бешенства на три формы (некоторые формы имеют разные стадии).

Формы развития и протекания бешенства у животных (клиническая картина):

Буйная форма бешенства:
1 Стадия. Животное избегает людей, прячется в темном и укромном месте. Может проявляться атипичное поведение - повышенная ласковость или пассивная агрессия. При этом возможно проявление зуда на месте укуса. Животное может разлизывать или выкусывать место проникновения вируса (нанесенной травмы). Аппетит снижается. Появляются рвота, слюнотечение и галлюцинации. Затрудняется акт глотания.
2 Стадия. Появляется ярко выраженная агрессия. Нарастает беспокойство, появляется склонность к поеданию несъедобных предметов. Неосознанное стремление к движению. Животное может кусать свое тело (самотравматизм), грызть окружающие предметы, амуницию, землю. Нападение на других животных и даже на хозяина. Питомец не может глотать воду. Из-за этого обильное и неконтролируемое слюноотделение. Прием пищи невозможен. Проявление судорожных припадков. Наступает частичная парализация мускулов лица и групп конечностей. В результате чего развивается косоглазие, нижняя челюсть отвисает, язык выпадает из пасти.
3 Стадия (терминальная — паралитическая). Депрессивное состояние. Сильное истощение организма, развитие паралича. Питомец почти постоянно лежит и впадает в коматозное состояние и кому. Смерть наступает в результате остановки дыхания на фоне паралича дыхательной мускулатуры.

Тихая форма бешенства:
Тихая форма характеризуется развитием паралича, слюнотечением, неспособностью принимать пищу. Через 2 - 4 дня питомец погибает. Фаза возбуждения (неистовства) кратковременна или отсутствует.

Атипичная форма бешенства:
Атипичная форма (сложная диагностируется). Возможно появление диареи или атонии кишечника. Возможно кратковременное улучшение состояния с последующими прогрессирующими неврологическими симптомами. В результате питомец погибает. Данная стадия протекания бешенства может длиться до 3-х месяцев и больше.

У крупного рогатого скота превалирует тихая форма. Возбуждение в этом случае выражено слабо, отмечают хриплое мычание, слюнотечение, шаткую походку, быстро развиваются параличи конечностей. Нередко атипичное течение - отказ от корма, атония преджелудков, частые позывы на дефекацию, приступы судорог, затем развиваются параличи. При буйной форме в момент припадка животные рвутся с привязи, ревут, роют землю, бросаются на стены, нападают на других животных своего вида, особенно агрессивны в отношении собак.
У овец и коз болезнь протекает почти так же, как у крупного рогатого скота, но параличи развиваются быстрее (на вторые сутки).
У лошадей и свиней преобладает буйная форма.

Профилактика бешенства у животных

Самым действенным и эффективным способом профилактики бешенства животных является вакцинация. По закону РФ ежегодная вакцинация обязательна для всех домашних и сельскохозяйственных животных. Сегодня имеется большой выбор вакцин от бешенства у животных, как импортных, так и отечественных производителей. Современные вакцины обеспечивают формирование иммунитета в течение трех лет. Ежегодная вакцинация от бешенства животных не представляет опасности для здорового питомца.

ГОСТ 26075-2013

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ЖИВОТНЫЕ

Методы лабораторной диагностики бешенства

Animals. Methods of Laboratory Diagnostic of Rabies

Дата введения 2015-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июня 2013 г. N 57-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 сентября 2013 г. N 1127-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 26075-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2015 года

5 ВЗАМЕН ГОСТ 26075-84


Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы лабораторной диагностики бешенства:

- метод флуоресцирующих антител (МФА);

- метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1);

- биопроба на белых мышах;

- метод иммуноферментного анализа (ИФА);

- реакция диффузионной преципитации (РДП).

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Lyssavirus .

2 Уличный вирус бешенства относится к микроорганизмам 2 класса патогенности (представляет смертельную опасность для человека и животных).

3 При необходимости генотипирования вируса бешенства с помощью готовых тест-систем применяют метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 17.0.0.01-76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 2768-84 Ацетон технический. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования.

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия.

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения

ГОСТ 25046-81 (ИСО 7864-81) Иглы инъекционные однократного применения. Основные размеры. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины, определения и сокращения

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.1 бешенство: Инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое представителями семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus (рабдовирус), и приводящее к летальному исходу в 100% случаев.

3.1.2 вирус бешенства: Возбудитель инфекционного заболевания человека и животных.

3.1.3 антиген вируса бешенства: Поверхностные белковые структуры вируса бешенства, на которые вырабатываются антитела.

3.1.2* метод флуоресцирующих антител (МФА): Метод выявления антигена вируса бешенства меченными флуоресцеинизотиоцианатом антирабическими антителами, с образованием характерных светящихся комплексов-включений, обнаруживаемых в поле зрения люминесцентного микроскопа.
________________

3.1.3 метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1): Метод выделения антигена вируса бешенства, основанный на размножении вируса в культуре клеток и его идентификации методом флуоресцирующих антител.

3.1.3* биопроба: Метод выделения вируса бешенства на белых мышах путем введения им суспензии патологического материала с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител.
________________
* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3.1.4 метод иммуноферментного анализа (ИФА): Метод выявления антигена вируса бешенства, основанный на его специфическом взаимодействии с антирабическим антителом, иммобилизованном на твердом носителе, с последующим выявлением связавшегося антигена с помощью второго меченного ферментом антитела путем окрашивания продукта реакции хромогеном.

3.1.5 реакция диффузионной преципитации (РДП): Метод выявления вируса бешенства, основанный на способности антител и вирусного антигена бешенства диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

3.1.6 метод обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (от-ПЦР): Метод выявления генома вируса бешенства путем перевода специфической последовательности РНК вируса в ДНК с последующим многократным копированием полученной ДНК и обнаружением продуктов реакции, осуществляемый in vitro.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

ФАГ - флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин;

АнГ - антирабический глобулин;

КФГ - контрольный флуоресцирующий глобулин;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

НГУК-1 - невринома Гассерова узла крысы;

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцинат;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

CCL-131 - культура клеток мышиной нейробластомы;

ОФД - ортофенилдиамин;

ТМБ - тетраметилбензидин.

4 Условия выполнения исследований и требования безопасности

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования проведения микробиологического анализа и работы с микроорганизмами I-II групп патогенности - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.2 Общие требования к помещениям - по ГОСТ ISO 7218 .

4.1.3 Требования к персоналу - по ГОСТ ISO 7218 , ГОСТ ИСО/МЭК 17025 , .

К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами I-II групп патогенности, изучившие методики микробиологических работ, вакцинированные против бешенства.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ согласно ГОСТ 12.1.008 .

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011 .

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005 .

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004 .

4.2.5 Утилизацию полученного для исследования материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 15 мин при давлении (0,11±0,20) МПа.

5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные

5.1 Для проведения исследований используют:

- спектрофотометр сканирующий со спектральным диапазоном измерения длин волн от 190 до 1100 нм с погрешностью не более ±0,5 нм и диапазоном измерения оптической плотности (ОП) от 0,1 до 3,0;

- планшеты для иммунологических реакций 96-луночные;

- термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 °С до 50 °С;

- холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °С до 10 °С по ГОСТ 16317 ;

- центрифугу лабораторную;

- баню водяную;

- микроскоп люминесцентный инвертированный по ГОСТ 8074 ;

- ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147 или гомогенизатор по ГОСТ ИСО/МЭК 17025 ;

- стекла предметные по ГОСТ 9284 ;

- пробирки стеклянные по ГОСТ 25336 ;

- чашки Петри по ГОСТ 25336 ;

- кювету по ГОСТ 25336 ;

- пипетки вместимостью 1,0; 2,0 и 10,0 см по ГОСТ 29230 ;

- пипетки автоматические вместимостью от 0,05 до 0,20 см с наконечниками;

- пинцеты медицинские по ГОСТ 21241 ;

- шприцы инсулиновые вместимостью 1,0 см по ГОСТ 22967 или ГОСТ 24861 ;

- иглы инъекционные по ГОСТ 25046 ;

- стекла культуральные на восемь лунок;

- клетки для содержания мышей;

- ацетон по ГОСТ 2603 или ГОСТ 2768 ;

- флуоресцирующий антирабический иммуноглобулин (ФАГ);

- антирабический глобулин (АнГ);

- контрольный флуоресцирующий глобулин (КФГ);

- масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739 ;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709 ;

- раствор фосфатно-буферный молярной концентрации 0,01 моль/дм (ФБР), рН 7,2-7,4;

- раствор натрия хлорида стерильный 0,9%-ный изотонический;

- культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1;

- пенициллин;

- стрептомицин;

- среду Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (ДМЕМ), рН 7,2;

- раствор трипсина 0,25%-ный;

- сыворотку эмбриональную крови крупного рогатого скота для культур клеток 10%-ную;

- глютамин 3%-ный:

- перекись водорода 3%-ную по ГОСТ 177 ;

- набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом ИФА;

- раствор серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм по ГОСТ 4204 ;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026 ;

- штамп для приготовления лунок;

- мертиолят;

- агар "Дифко" или аналогичный;

- раствор метилового оранжевого 1%-ный в 50%-ном этиловом спирте;

- антигены положительный и отрицательный;

- сыворотку антирабическую или иммуноглобулин;

- мышей белых клинически здоровых массой 6-8 г.

5.2 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше. Допускается использование посуды одноразового применения.

6 Отбор проб

6.1 Для проведения исследований на наличие вируса бешенства в лабораторию направляют патологический материал - свежий труп или голову мелких животных, голову или головной мозг крупных животных.

6.2 Отобранный для исследований патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и доставляют в лабораторию в металлических контейнерах. Замороженный материал помещают в криоконтейнер.

6.3 Патологический материал сопровождают документом, содержащим следующие данные: наименование и адрес отправителя, вид животного, анамнестические и клинико-эпизоотологические данные.

6.4 Лабораторные исследования проводят сразу же при получении патологического материала.

6.5 Для исследования отбирают от крупных животных кусочки ткани из каждого отдела головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кору больших полушарий, продолговатый мозг) размером 0,5-1,0 см, мозг мелких животных, например мышей, исследуют целиком.

Для исследования МФА и методом выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) пригодны только свежие или свежезамороженные пробы ткани головного мозга. Не допускаются для исследований пробы мозга животных, разлагающиеся (в стадии загнивания), консервированные глицерином, фиксированные метиловым спиртом, формалином или другими средствами, способствующими возникновению неспецифической флуоресценции.

Для постановки биопробы допускается использовать пробы мозга, консервированные в 30%-50%-ном растворе глицерина. Использование других консервантов не допускается. Для сохранности патологический материал может быть заморожен при температуре не выше минус 10 °С.

7 Метод флуоресцирующих антител (МФА)

7.1 Сущность метода

Сущность метода флуоресцирующих антител заключается в специфическом взаимодействии флуоресцирующих антирабических антител с гомологичным антигеном вируса бешенства. Образующийся при этом комплекс "антиген-антитело", меченный ФИТЦ, обнаруживается визуально по характерному свечению в поле зрения при рассмотрении под люминесцентным микроскопом.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка проб

7.2.1.1 Из кусочков ткани, отобранных по 6.5, готовят не менее трех препаратов (отпечатков или мазков) из каждого отдела мозга на тщательно обезжиренных предметных стеклах. Если состояние патологического материала позволяет, то готовят отпечатки, в остальных случаях делают мазки.

7.2.1.2 Приготовление отпечатков

Кусочки ткани, отобранные по 6.5, кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. Мозг мелких животных разрезают поперек, захватывая все его отделы, и кладут его пинцетом срезом вверх на фильтровальную бумагу, сложенную в четыре-шесть слоев. К поверхности среза прикасаются предметным стеклом, слегка надавливая его до получения на стекле тонкого отпечатка.

7.2.1.3 Приготовление мазков

Кусочек ткани из каждого отдела мозга (у мелких животных весь мозг целиком), отобранный по 6.5, растирают в фарфоровой ступке пестиком до образования гомогенной массы, из которой делают мазки на предметных стеклах.

7.2.1.4 Для контроля делают мазки или отпечатки из мозга здоровых, не болевших бешенством и не вакцинированных против бешенства, белых мышей, как описано в 7.3.1.2 и 7.3.1.3.

7.2.1.5 После приготовления мазки или отпечатки высушивают на воздухе в течение 20-30 мин, фиксируют в охлажденном ацетоне при температуре 4 °С в течение 4-12 ч или при температуре минус 20 °С в течение 1 ч, после чего извлекают из ацетона и высушивают на воздухе в течение 10-15 мин.

7.2.2 Подготовка реактивов

ФАГ, АнГ и КФГ растворяют дистиллированной водой до указанного на этикетке ампулы первоначального объема. Срок хранения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ при температуре (5±2) °С - не более двух недель.

Непосредственно для исследования необходимое количество растворенных ФАГ, АнГ и КФГ разводят ФБР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Рабочие разведения растворенных ФАГ, АнГ и КФГ используют в день приготовления.

7.3 Проведение исследования

Предметные стекла с препаратами (мазками или отпечатками) по 7.2.1 помещают во влажную камеру (чашку Петри или кювету с увлажненным дном). Затем на один из трех приготовленных препаратов наносят ФАГ в рабочем разведении равномерно на всю поверхность мазка или отпечатка при помощи пипетки. На второй препарат наносят рабочее разведение КФГ. Закрывают камеру с препаратами, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Параллельно окрашивают контрольные препараты. По окончании окрашивания препараты трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На третий препарат наносят рабочее разведение АнГ, помещают в термостат при температуре (37±1) °С и выдерживают в течение 30 мин. Затем препарат трехкратно промывают, погружая каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе в течение 20-30 мин и окрашивают рабочим разведением ФАГ, как описано выше.

7.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства мозговая ткань светится тусклым, серовато-желтым цветом.

Антиген вируса бешенства выявляется в нейронах и вне клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих размер в диаметре 15-20 мкм. Иногда отмечается большое количество мелких ярких зеленых частиц (размером до 1 мкм) округлой и овальной формы.

Диагноз бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желтовато-зеленые гранулы. При этом в контрольных препаратах (в мазках или отпечатках из мозга здоровых не болевших бешенством белых мышей, окрашенных ФАГ), а также в исследуемых препаратах, окрашенных КФГ и предварительно обработанных АнГ и окрашенных ФАГ, подобных образований быть не должно.

О результатах исследования сообщают компетентным органам в соответствии с порядком, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

В случае отрицательного результата проводят исследования по 8 или 9.

8 Метод выделения вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или невриномы Гассерова узла крысы - НГУК-1)

8.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства в культуре клеток мышиной нейробластомы CCL31 или НГУК-1 с последующей его идентификацией методом флуоресцирующих антител.

Метод является альтернативным биопробе на белых мышах по 9.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Подготовка проб

Равные части ткани, стерильно отобранные из каждого участка головного мозга мелкого животного (аммоновы рога, мозжечок, кора больших полушарий, продолговатый мозг), или кусочки ткани из каждого отдела головного мозга крупного животного, отобранные по 6.5, измельчают ножницами и растирают в ступке или гомогенизаторе, постепенно добавляя стерильный 0,9%-ный изотонический раствор натрия хлорида до получения 10%-ной суспензии. В суспензию мозга добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/см и 1 мг/см соответственно.

Полученную суспензию тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку и хранят при температуре не выше 4 °С до использования.

8.2.2 Подготовка культуральных стекол

Суточную культуру клеток мышиной нейробластомы CCL-131 (или НГУК-1) снимают с культурального флакона при помощи 0,25%-ного раствора трипсина и разводят средой ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной сывороткой крови крупного рогатого скота и 3%-ным глютамином до концентрации 210 клеток/см. В лунки культурального стекла вносят по 0,1 см полученной суспензии клеток, накрывают крышкой и помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 18-20 ч.

8.3 Проведение исследования

В две лунки культурального стекла по 8.2.2 вносят по 0,05 см суспензии из каждого отдела головного мозга. На каждом стекле оставляют две лунки для положительного и отрицательного контроля. В качестве положительного контроля используют суспензию мозга мыши, зараженной вирусом бешенства - штаммом CVS. В качестве отрицательного контроля вносят суспензию мозга клинически здоровой мыши. Культуральное стекло помещают во влажный -инкубатор с содержанием 5% при температуре (37±1) °С на 42-48 ч.

По окончании инкубации с помощью автоматической пипетки из лунок культурального стекла удаляют среду, один раз промывают клетки ФБР (с помощью автоматической пипетки вносят по 0,2 см раствора в каждую лунку) и подсушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. Затем в каждую лунку вносят по 0,1 см охлажденного до температуры минус 20 °С ацетона и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

После фиксации клеток культуральное стекло переворачивают и встряхивают для удаления ацетона, а затем высушивают в ламинарном потоке воздуха в течение 20-30 мин. С помощью скальпеля и пинцета удаляют пластиковую насадку и подсушивают стекло еще в течение 5-10 мин. В каждую лунку добавляют по 0,05-0,10 см ФАГ в рабочем разведении (подбирают опытным путем), приготовленном в ФБР, помещают во влажную чашку Петри и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.

По окончании окрашивания стекла трехкратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд с ФБР. Затем препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе в течение 20-30 мин.

На окрашенные препараты наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают в люминесцентном микроскопе.

8.4 Обработка результатов

В окрашенных препаратах не пораженная вирусом бешенства культура клеток светится тусклым, серовато-желтым цветом (отрицательный контроль). Антиген вируса бешенства выявляется в цитоплазме культуры клеток в виде ярких зеленых гранул различной формы и величины с четкими очерченными краями (положительный контроль).

Диагноз на бешенство считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа в исследуемом препарате обнаруживают типичные желто-зеленые гранулы.

Если в культуре клеток вирус бешенства не выявлен, то ставится отрицательный диагноз.

Результаты выделения вируса бешенства в культуре клеток окончательные, дальнейшие исследования не проводят.

9 Биопроба на белых мышах

9.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выделении вируса бешенства путем интрацеребрального введения патологического материала белым мышам с последующей идентификацией вируса методом флуоресцирующих антител по 7.

9.2 Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

9.3 Проведение исследования

Пять-шесть белых мышей заражают 10%-ной суспензией патологического материала интрацеребрально в объеме 0,02-0,03 см. Зараженных мышей помещают в отдельную клетку, на которую наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения и номера экспертизы патологического материала. Наблюдение за животными проводят не менее 30 дней. Количество здоровых, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

9.4 Обработка результатов

При оценке результатов учитывают наличие клинических признаков у зараженных мышей (взъерошенность шерсти, поедаемость корма, нарушение координации движения, параличи, тремор, прострация). Гибель мышей в первые двое суток после заражения не учитывают. Пробы мозга от больных и погибших животных, начиная с третьих суток, исследуют МФА по 7.

Биопробу считают положительной, если, начиная с третьих суток после заражения, заболела и погибла хотя бы одна мышь и в пробе мозга с помощью МФА обнаружены специфические включения вируса бешенства.

Отрицательный диагноз может быть дан только по истечении 30 сут наблюдения при условии, что все зараженные животные останутся живыми и здоровыми.

Результаты биопробы считаются окончательными, дальнейшие исследования не проводят.

10 Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

10.1 Сущность метода

В основе ИФА лежит специфическое взаимодействие антигена вируса бешенства с антителом, иммобилизованным на твердом носителе. Связанный антиген выявляется с помощью второго антирабического антитела, меченного пероксидазой, продукт реакции которой окрашивается при добавлении хромогена. Интенсивность окрашивания продукта реакции прямо пропорциональна количеству антигена.

10.2 Подготовка к исследованию

10.2.1 В качестве исследуемого материала (антиген) используют пробы ткани головного мозга павших, вынужденно убитых, подозреваемых в заболевании бешенством или экспериментально зараженных вирусом бешенства животных.

10.2.2 Приготовление исследуемого антигена

Пробы ткани головного мозга, полученные по 6.5, измельчают, растирают в ступке и готовят 10%-ные суспензии в 0,9%-ном изотоническом растворе хлористого натрия, прогревают в водяной бане при температуре 60 °С в течение 15 мин и центрифугируют в течение 5-10 мин при скорости 2000 об./мин. Надосадочную жидкость используют в качестве исследуемого антигена.

10.2.3 Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты перед постановкой реакции необходимо выдержать не менее 30 мин при температуре (22±1) °С.

Подготовку компонентов набора проводят согласно инструкции по применению.

10.3 Проведение исследования

10.3.1 ИФА проводят в сэндвич-варианте с использованием компонентов, входящих в набор для выявления антигена возбудителя бешенства в патологическом материале.

Для проведения ИФА используют планшеты для иммунологических реакций с плоским дном.

Объем ингредиентов, вносимых поэтапно в лунки планшета, равен между собой и составляет 0,1 см.

10.3.2 Сенсибилизация планшета

В лунки полистиролового планшета вносят АнГ в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с АнГ накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 3 ч или при температуре 4 °С в течение 18 ч. По окончании инкубации лунки планшета трехкратно промывают отмывающим буферным раствором. При каждой отмывке содержимое лунок вытряхивают, а остатки раствора удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

10.3.3 Внесение антигенов

В ряды планшета A, B и C вносят отмывающий буфер. В лунки планшета вносят контрольные положительный (лунка A1) и отрицательный (лунка A2) антигены, входящие в состав набора, а также исследуемые пробы (лунки A3, A4 и т.д.) и титруют по вертикали, получая разведения от 1:2 до 1:8. При большом количестве проб заполняют и другие ряды планшета. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета от не связавшихся с иммуноглобулином антигенов, как описано в 10.3.2.

10.3.4 Внесение антирабического пероксидазного конъюгата

В лунки планшета вносят антирабический пероксидазный конъюгат в рабочем разведении, после чего накрывают крышкой и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5) °С в течение 1 ч. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, как описано в 10.3.2.

10.3.5 Внесение субстратной смеси

Для проявления реакции в лунки планшета вносят готовую субстратную смесь. Реакцию проявляют в течение 15-30 мин при температуре (22±0,5) °С в темноте. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты молярной концентрации 2 моль/дм.

10.4 Обработка результатов

Учет реакции проводят визуально или на сканирующем спектрофотометре в соответствии с инструкцией по применению набора.

Если в субстратной смеси в качестве хромогена используют ОФД, то измерение оптической плотности проводят при 490 нм, если используют ТМБ, то при 450 нм.

Реакцию учитывают только в том случае, если в лунках с контрольным отрицательным антигеном специфическое окрашивание отсутствует при интенсивном окрашивании в лунках с контрольным положительным антигеном. При визуальном учете пробу считают положительной, если хотя бы в одном (первом) разведении наблюдается специфическое окрашивание.

При спектрофотометрическом учете результата ИФА проводят расчет коэффициента специфичности , который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном или исследуемым материалом (ОП) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности более 2,1 и отрицательной, если менее 2,1.

Пример

ОП 0,641, ОП 0,120, 5,34 - реакция положительная или ОП 0,180, ОП 0,120 1,5 - реакция отрицательная.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-9.

11 Реакция диффузионной преципитации (РДП)

11.1 Сущность метода

Сущность метода РДП заключается в способности антител и вирусного антигена диффундировать в агаровом геле и при специфическом взаимодействии образовывать комплекс "антиген-антитело", наблюдаемый невооруженным глазом в виде линии преципитации.

11.2 Подготовка к исследованию

11.2.1 Подготовка проб

Подготовка проб к исследованию - по 8.2.1.

Для исследования допускаются несвежие пробы мозга животных, контаминированные бактериальной микрофлорой.

11.2.2 Подготовка агара

Для приготовления агара смешивают 1,5 г агара "Дифко", 1 см 1%-ного раствора метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте, 0,01 г мертиолята, 100 см изотонического раствора натрия хлорида. Полученную смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают по пробиркам, автоклавируют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин и хранят в холодильнике при температуре 4 °С.

11.2.3 Подготовка предметных стекол (чашек Петри)

Реакцию ставят либо на предметных стеклах, либо на чашках Петри. На обезжиренное стекло наносят каплю расплавленного агара, равномерно распределяют ее по стеклу и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин для застывания агара. Затем наносят на стекло 2,5 см расплавленного агара, образуя слой толщиной около 2 мм, и оставляют на 20-30 мин. В застывшем слое агара с помощью специального штампа или металлической тонкостенной трубочки диаметром 4-5 мм делают лунки. Столбики агара осторожно извлекают, не повреждая и не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля, с помощью глазного пинцета или другого инструмента.

Чашки Петри готовят аналогично, внося в них 10-15 см расплавленного агара для получения слоя толщиной 2-3 мм.

11.3 Проведение исследования

Непосредственно перед постановкой реакции готовят разведения антирабической сыворотки (иммуноглобулина), для чего в четыре пробирки вносят по 1,0 см изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку добавляют 1,0 см антирабической сыворотки, получая разведение 1:2, перемешивают, и переносят 1,0 см смеси во вторую пробирку и т.д. Таким образом, получают четыре пробирки с разведениями 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16.

В приготовленные лунки вносят по 0,05-0,07 см пробы мозга (каждую пробу в отдельную лунку), полученной по 8.2.1, и разведения антирабической сыворотки или иммуноглобулина (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) согласно рисунку 1.

Рисунок 1 - Схема внесения материала

Ар - аммонов рог; Пм - продолговатый мозг; А+ - положительный контрольный антиген; М - мозжечок; К - кора больших полушарий; А- - отрицательный контрольный антиген

Возможно применение других схем внесения материала, но при этом обязательно использование положительного и отрицательного антигенов.

Предметные стекла с исследуемым материалом помещают в чашки Петри с увлажненным дном или влажный эксикатор, а затем в термостат при температуре (37±1) °С на 48 ч (чашки Петри накрывают крышкой и помещают в термостат).

Реакцию учитывают через 6, 24 и 48 ч.

11.4 Обработка результатов

Реакцию считают положительной при появлении даже одной линии преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими исследуемый материал и антирабическую сыворотку (иммуноглобулин).

При этом между положительным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) должна наблюдаться заметная линия преципитации, а между отрицательным антигеном и антирабической сывороткой (иммуноглобулином) линии преципитации быть не должно.

В случае положительной реакции диагноз считают установленным. Отрицательный результат должен быть подтвержден другими методами по 7-10.

Библиография

ЕС Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products for Human and Veterinary Use



УДК 619:616.98:579.852.1:615371 МКС 11.220

Ключевые слова: бешенство, диагностика, метод флуоресцирующих антител, иммуноферментный анализ, биопроба, реакция диффузионной преципитации

____________________________________________________________________________________

Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2014

Культивирование и репродукция

Патогенез и иммунитет

Эпидемиология

Профилактика

Бешенство

Лабораторная диагностика

Метод флуоресцентных антител

Обнаружение телец Бабеша-Негри

Метод обнаружения включений Бабеша-Негри

Биопроба на мышах

Серологические исследования