Бактерии в борьбе против человека берут верх, антибиотики не справляются. Ученым удалось разобраться в природном механизме уничтожения бактерий. Это поможет созданию новых классов препаратов против инфекций.

Текст: Галина Костина

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) буквально вопиет о . Глава ВОЗ Маргарет Чен на одной из недавних европейских конференций говорила, что медицина возвращается в доантибиотиковую эру. Новые лекарства практически не разрабатываются. Ресурсы исчерпаны: «Постантибиотиковая эра в действительности означает конец современной медицины , которую мы знаем. Такие распространенные состояния, как стрептококковое воспаление горла или царапина на коленке ребенка, смогут снова приводить к смерти». По данным ВОЗ, более 4 млн детей в возрасте до пяти лет ежегодно умирают от инфекционных заболеваний.

Главной проблемой становится . В Европе бьют тревогу: уровень резистентности, например, пневмонии достиг 60% — в полтора раза больше, чем четыре года назад. В последние годы пневмония и другие инфекции, вызываемые только патогенными бактериями, ежегодно уносят жизни примерно 25 тыс. европейцев.

Многие помнят нашумевшую в 2011 году историю, когда в Германии острой кишечной инфекцией заразились более 2000 человек, более 20 человек умерли, а у 600 вследствие болезни отказали почки. Причиной стала устойчивая к ряду групп антибиотиков кишечная палочка E. coli, принесенная, а затем, как выяснилось, на проростках пажитника.

По прогнозам ВОЗ, через 10-20 лет все микробы приобретут устойчивость к существующим антибиотикам. Но оружие против бактерий есть у природы. И ученые пытаются поставить его на службу медицине.

Бактериальные надсмотрщики

Бактерии долгое время считались самой многочисленной популяцией живых организмов на Земле. Однако не так давно выяснилось, что бактериофагов (бактериальных вирусов) еще больше. Немного, конечно, странная ситуация: почему же тогда фаги не изничтожили все бактерии? Как всегда, в природе все непросто. Природа устроила микромир таким образом, чтобы популяции фагов и бактерий пребывали в динамическом равновесии. Достигается это избирательностью фагов, теснотой их общения с соответствующими бактериями, способами защиты бактерий от фагов.

Считается, что фаги почти такие же древние, как и бактерии. Открыли их почти одновременно Фредерик Творт и Феликс Д’Эрель в начале XX века. Первый, правда, не рискнул обозначить их как новый класс вирусов. Зато второй методично описал вирусы дизентерийных бактерий и назвал их в 1917 году бактериофагами — пожирателями бактерий. Д’Эрель, смешивавший бактерии и вирусы, увидел, как культура бактерий буквально растворялась на глазах. И почти сразу же французский ученый стал делать попытки использования вирусов против дизентерии в детской клинике. Любопытно, что потом француз продолжил свои эксперименты в Тбилиси и открыл там институт, который занимался почти исключительно вопросами фаговой терапии.

Вслед за Д’Эрелем фагами увлеклись многие ученые и медики. Где-то их опыты были удачными и вдохновляющими, где-то провальными. Теперь это легко объяснить: бактериофаги очень избирательны, практически каждый вирус выступает против какой-то определенной бактерии, иногда даже конкретного ее штамма. Конечно, если потчевать больного не теми фагами, то лучше ему не станет.

А в 1929 году Александр Флеминг о — пенициллин, и с начала 1940-х началась эра антибиотиков. Как часто бывает, о бактериофагах практически забыли, и только в России и в Грузии продолжали потихоньку производить фаговые препараты.

Интерес к бактериофагам возродился в 1950-х, когда их стали использовать в качестве удобных модельных организмов. «Многие фундаментальные открытия в молекулярной биологии, связанные с генетическим кодом, репликацией и другими клеточными механизмами, были сделаны во многом благодаря бактериофагам», — рассказывает руководитель лаборатории молекулярной биоинженерии Института биоорганической химии (ИБХ) им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН Константин Мирошников . Взрывное развитие микробиологии и генетики накопило огромные знания как о фагах, так и о бактериях.

Лаборатория Вадима Месянжинова ИБХ РАН, где 15 лет назад вместе работали Константин Мирошников, Михаил Шнейдер , Петр Лейман и Виктор Костюченко , занималась бактериофагами, в частности фагом Т4. «Так называемые хвостатые фаги делятся на три группы, — рассказывает Мирошников. — У одних маленький, почти символический хвостик, у других — длинный и гибкий, а у третьих — сложный, многокомпонентный сократимый хвост. Последняя группа фагов, к которой относится Т4, называется миовиридами».

На картинках Т4 напоминает фантастический летающий объект с головкой, в которой находится ДНК, с прочным хвостом и ножками — белками-сенсорами. Нащупав ножками-сенсорами подходящую бактерию, бактериофаг прикрепляется к ней, после чего наружная часть хвоста сокращается, проталкивая вперед внутренний поршень, протыкающий оболочку бактерии. За это хвост фага прозвали молекулярным шприцем. Через поршень фаг вводит в бактерию свою ДНК и ждет, когда в ней наплодится его потомство. После завершения репродуктивного цикла детки фага разрывают стенку бактерии и способны к заражению других бактерий.

на фото: Михаил Шнейдер (слева) и Константин Мирошников из ИБХ РАН («Эксперт»)

Ученые, по словам Константина Мирошникова, долго не хотели верить, что фаг использует такой примитивный метод — механическое протыкание бактерии, — ведь практически все биологические процессы построены на биохимических реакциях. Тем не менее оказалось, что так и есть. Правда, это всего лишь часть процесса. Как позже выяснилось, механически протыкается наружная оболочка бактерии — плазматическая мембрана. В составе молекулярного шприца есть фермент лизоцим, который проделывает небольшое отверстие во внутренней оболочке клетки. Наибольший интерес для ученых представлял белок «шприца» — его своеобразная игла, которая протыкает внешнюю оболочку. Оказалось, что он, в отличие от многих других белков, обладает замечательно стабильной структурой, что, видимо, необходимо для такого сильного механического воздействия.

Российские ученые вместе с коллегами из Университета Пурдью (США) построили молекулярную модель фага Т4. В дальнейшем, изучая подробности этого необычного молекулярного оружия бактериофага, ученые натолкнулись еще на одну загадку. Электронная микроскопия, выполненная Виктором Костюченко, показала, что на конце иглы есть еще один маленький белочек. И в лаборатории вновь задались вопросом: что же это за белок и зачем он нужен? Однако в то время понять это не удалось.

Один из учеников Вадима Месянжинова, Петр Лейман, работавший после ИБХ в Университете Пурдью, а затем в Швейцарском институте технологии в Лозанне (EPFL), позднее вернулся к этой теме, правда, с другой стороны — со стороны бактерий. Одним из фокусов работы новой лаборатории стали не бактериофаги, а бактерии, которые атакуют своих недружелюбных соседей при помощи машинки, очень похожей на молекулярный шприц фага. По-научному она называется системой секреции 6-го типа (СС6Т). И эта система оказалась еще более интересной.

Смерть на кончике иглы

«Система секреции шестого типа была открыта в 2006 году, — рассказывает Петр Лейман. — Однако в то время еще было не ясно, насколько она похожа на хвост бактериофага. Это открытие было сделано благодаря накопленным знаниям об отсеквенированных геномах сотен бактерий». В течение последующих трех лет исследований выяснилось, что конструктивно СС6Т — это почти то же, что и хвост бактериофага. Он также имеет внешний сокращаемый чехол, внутренний поршень и иглу с наконечником. И эта молекулярная машина пробивает дырку в оболочке бактерии.

По словам Константина Мирошникова, вполне возможно, что за миллионы лет сосуществования предприимчивая бактерия вполне могла перенять от бактериофага его оружие, для того чтобы использовать его в борьбе с другими бактериями. При этом бактерия избавилась от фаговой «головы» — чужая генетическая информация бактерии была не нужна. Зато его чудесный хвост она вставила в свой геном. Правда, бактерия его значительно модифицировала. СС6Т намного сложнее, чем молекулярный шприц бактериофага. Бактериофаг делает аккуратную дырочку, не намереваясь мгновенно убить бактерию, чтобы потом размножиться в ней. Бактерии же нужно быстро и гарантированно убить бактерию-конкурента, поэтому она сразу делает много больших дырок в теле врага.

Группа Петра Леймана в сотрудничестве с Михаилом Шнейдером из лаборатории ИБХ среди прочих задач искала в этой системе тот самый маленький белочек на конце шприца, который когда-то они увидели у бактериофага Т4. Они-то не сомневались, что он там есть и что у него должна быть важная функция в этом механизме. «Многие не верили, что на кончике иглы что-то есть и что это может быть важно, — рассказывает Петр Лейман. — А мы упорно искали. И все-таки мы его нашли!»

Ученые выяснили, что к этому маленькому белку-наконечнику могут присоединяться различные токсины, которые неминуемо убьют другую бактерию, после того как ее проткнет наконечник. В частности, выяснилось, что одним из таких токсинов может быть лизоцим, аналог того, что сидит и на молекулярном шприце фага. Но, сидя на фаге, он проделывает крохотную дырочку в клеточной стенке и не проникает внутрь бактерии, а в СС6Т он разрушает клеточную стенку бактерии, что ведет к ее гибели.

Впрочем, лизоцим не единственный токсин, который использует бактерии, их десятки и сотни. Причем, по словам Леймана, они могут проникать в чужую бактерию, как сидя на наконечнике, так и выпрыскиваясь изнутри шприца. Но и на этом хитрости не заканчиваются. Оказалось, что у бактерии есть несколько таких сменных наконечников, которые она выбирает в зависимости от того, на какого недруга собирается нападать и чем будет этого недруга потчевать. Ну и еще одна инновация бактерии: СС6Т — система не одноразовая, как молекулярный шприц бактериофага, а многоразовая. После того как она протыкает бактерию-врага и доставляет в нее токсины, та часть системы, что находится внутри нападающей клетки, распадается на элементы, из которых бактерия собирает новый «шприц» — систему СС6Т, заряженную токсинами. И снова готова к бою.

Это интересное фундаментальное открытие (посвященная ему статья опубликована недавно в Nature), однако, требует продолжения. «Пока для нас одна из самых загадочных вещей, — продолжает Лейман, — как система секреции отбирает для транспортировки сменные наконечники и токсины. У нас уже есть некоторые наработки, но мы еще в процессе». Петр Лейман не сомневается, что в ближайшие годы эти детали наконец будут прояснены. Над этим, по его словам, только в Швейцарии работают несколько лабораторий и еще десятки лабораторий во всем мире. Знание о том, как работает убийственный механизм СС6Т, может способствовать разработке нового класса лекарств, которые будут избирательно убивать болезнетворные бактерии. Медицина этого открытия очень ждет.

Время запускать фагов

Эра антибиотиков, начавшаяся в середине прошлого века и вызвавшая всеобщую эйфорию, похоже, заканчивается. И об этом предупреждал еще отец антибиотиков Флеминг. Он предполагал, что хитроумные бактерии будут все время изобретать механизмы выживания. Всякий раз, сталкиваясь с новым лекарством, бактерии словно проходят сквозь бутылочное горлышко. Выживают сильнейшие, приобретшие механизм защиты от антибиотика. Кроме того, безудержное и неконтролируемое использование антибиотиков, особенно в сельском хозяйстве, ускорило приближение конца их эры. Чем активнее применялись антибиотики, тем быстрее приспосабливались к ним бактерии. Особой проблемой стали внутрибольничные инфекции, возбудители которых чувствуют себя как дома в святая святых — стерильных отделениях клиник. Там, среди больных с ослабленным иммунитетом, даже так называемые условно-патогенные микробы, не представляющие для здорового человека никакой опасности, но приобретшие солидный спектр устойчивости к антибиотикам, становятся жестокими патогенами и добивают пациентов.

По словам Михаила Шнейдера, антибиотики, как правило, берутся из природы, как тот же пенициллин. Синтезированных антибиотиков очень мало: трудно поймать в бактериях уязвимые места, на которые можно было бы нацелиться. К тому же, сетуют медики, разработчики не очень охотно берутся за создание новых антибиотиков: мол, возни с разработками много, устойчивость к ним вырабатывается у бактерий слишком быстро, а цена на них не может быть такой высокой, как, к примеру, на антираковые препараты. По некоторым данным, к концу первого десятилетия XXI века лишь полтора десятка новых антибиотиков находились в разработках крупных компаний, да и то на очень ранних стадиях. Тут-то и стали вспоминать о природных врагах бактерий — бактериофагах, которые хороши еще и тем, что практически нетоксичны для человеческого организма.

В России терапевтические фаговые препараты делают давно. «Я держал в руках затрепанную методичку времен финской войны по применению фагов в военной медицине, фагами лечили еще до антибиотиков, — рассказывает Константин Мирошников. — В последние годы фаги широко использовали при наводнениях в Крымске и Хабаровске, чтобы предотвратить дизентерию. У нас такие препараты в промышленных масштабах много лет делает НПО "Микроген”. Но технологии их создания давно нуждаются в модернизации. И мы последние три года сотрудничаем с “Микрогеном” по этой теме».

Бактериофаги кажутся отличным оружием против бактерий. Во-первых, они высокоспецифичны: каждый фаг убивает не просто свою бактерию, но даже конкретный ее штамм. По словам Михаила Шнейдера, бактериофаги можно было бы использовать и в средствах диагностики для определения бактерий до штаммов, и в терапии: «Их можно использовать и сами по себе, и в комбинации с антибиотиками. Антибиотики хотя бы частично ослабляют бактерии. А фаги могут добить их».

Сейчас во многих лабораториях думают, как можно было бы использовать как бактериофаги, так и их компоненты против бактериальных инфекций. «В частности, американская компания Avidbiotics разрабатывает продукты на основе бактериоцинов, которые представляют собой модифицированный фаговый хвост — молекулярный шприц, направленный на уничтожение вредоносных бактерий, — рассказывает Михаил Шнейдер. — Они создали своеобразный молекулярный конструктор, у которого можно легко менять сенсорный белок, распознающий конкретную патогенную бактерию, благодаря чему можно получить много высокоспецифичных препаратов».

Сейчас в разработке компании — препараты, которые будут направлены против кишечной палочки, сальмонеллы, шигеллы и других бактерий. Кроме того, компания готовит препараты для продовольственной безопасности и заключила соглашение с компанией DuPont о создании класса антибактериальных агентов для защиты продуктов питания.

Перед Россией, казалось бы, широкая дорога для создания новых классов препаратов на основе фагов, но пока энергичных действий в этом плане не видно. «Мы не производственники, но примерно себе представляем, в какую канитель могут вылиться сертификация и внедрение современного препарата на основе фагов или бактериоцинов, — говорит Мирошников. — Ведь он должен будет пройти путь нового лекарства, а это занимает до десятка лет, потом еще нужно будет утверждать каждую деталь такого конструкторского препарата с заменяемыми частицами. Пока что мы можем давать лишь научные рекомендации, что можно было бы сделать». А в том, что делать надо, нет сомнений ни у кого из тех, кто осведомлен о катастрофе с антибиотиками.

На смену фагам вскоре могут прийти и новые технологии, которые будут использовать механизмы СС6Т. «Мы еще в процессе исследований и пока далеки от рационального использования системы секреции шестого типа, — говорит Петр Лейман. — Но я не сомневаюсь, что эти механизмы будут раскрыты. И тогда на их основе можно будет делать не только высокоспецифичные препараты против злостных бактерий, но и использовать их как средство доставки нужных организму белков, даже очень крупных, что сейчас является проблемой, а также доставки лекарств, например, в опухолевые клетки».

В мае этого года в работе "Mitochondria-targeted antioxidants as highly effective antibiotics", опубликованной в журнале Scientific Reports, коллектив авторов из МГУ впервые показал принципиально новый гибридный антибиотик: его действие направлено против мембранного потенциала бактерий, который обеспечивает болезнетворные клетки энергией.

Победа! — но только временная

В середине прошлого столетия человечество находилось в состоянии эйфории, связанной с невероятными успехами в лечении инфекционных заболеваний бактериальной природы. Многие бактериальные инфекции, вызывавшие ужасающие по количеству жертв эпидемии в средние века, превратились в карантинные инфекции, которые легко и эффективно вылечивались.

Этот успех стал возможен после открытия в 1920-х годах британским бактериологом Александром Флемингом первого антибиотика — пенициллина; он обнаружился в плесневых грибах Penicillium notatum . Спустя десятилетие британские ученые Говард Флори и Эрнст Чейн предложили способ промышленного производства чистого пенициллина. Все трое в 1945 году были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины.

Массовое производство пенициллина было налажено во время Второй мировой войны, что вызвало резкое уменьшение смертности среди солдат, обычно умиравших от раневых инфекций. Это позволило французским газетам накануне визита Флеминга в Париж писать, что для разгрома фашизма и освобождения Франции он сделал больше целых дивизий.

Углубление знаний о бактериях привело к появлению большого числа антибиотиков, разнообразных по механизму, широте спектра действия и химическим свойствам. Почти все бактериальные заболевания либо полностью вылечивались, либо серьезно подавлялись антибиотиками. Люди полагали, что человек победил бактериальные инфекции.

Мелкие очаги сопротивления — и поражение

Одновременно с успехами появились и первые признаки грядущей глобальной проблемы: случаи бактериального сопротивления антибиотикам. Прежде безропотно чувствительные к ним микроорганизмы вдруг становились индифферентны. Человечество ответило бурным развитием исследований и новыми антибиотиками, это привело лишь к увеличению числа препаратов и новой резистентности бактерий.

В мае 2015 года Всемирная организация здравоохранения признала кризисом бактериальное сопротивление антибиотикам и выдвинула Глобальный план борьбы с устойчивостью к противомикробным препаратам. Его следовало выполнить безотлагательно, свои действия должны были координировать многочисленные международные организации вроде защитников окружающей среды, и отрасли экономики — не только человеческая медицина, но и ветеринария, и промышленное животноводство, и финансовые институты, и общества защиты прав потребителей.

План, должно быть, так или иначе выполняется, но к несчастью, несмотря на это уже в сентябре 2016 года одна американская пациентка умерла от сепсиса. Такое бывает, и даже чаще, чем хотелось бы, но ее погубила так называемая супербактерия — Klebsiella pneumoniae , но не обычная, а устойчивая ко всем разрешенным в США 26 антибиотикам, в том числе к антибиотику "последнего резерва" колистину.

Итак, ученым стало очевидно, что бактериальные инфекции побеждают человечество, и современная медицина может быть отброшена во времена, предшествовавшие открытию антибиотиков. Одним из главных вопросов, поднятых на международной конференции ASM Microbe , проводившейся в Новом Орлеане в июне 2017 года Американским обществом микробиологов, был такой: "Может ли человечество выиграть войну с микробами?". На той же конференции, кстати, отдельного внимания удостоилось движение antimicrobial stewardship, или управление антибиотикотерапией, которое имеет своей целью максимально разумно и достаточно, в соответствии с рекомендациями доказательной медицины, назначать антибиотики. Пока что законом такое обращение с антибиотиками стало только в одном месте в мире — в штате Калифорния, США.

Стало очевидным, что бактериальные инфекции побеждают человечество, и современная медицина может быть отброшена на уровень, предшествующий открытию антибиотиков

Как работает помпа

Действие помпы можно проиллюстрировать на примере основной помпы множественной лекарственной устойчивости кишечной палочки — AcrAB-TolC . Эта помпа состоит из трех основных компонентов: (1) белка внутренней клеточной мембраны AcrB , который за счет мембранного потенциала может перемещать вещества через внутреннюю мембрану (2) адаптерного белка AcrA , связывающего транспортер AcrB с (3) каналом на внешней мембране TolC . Точный механизм работы помпы остается недостаточно изученным, однако известно, что вещество, которое помпа должна выбросить за пределы клетки, попадает на внутреннюю мембрану, где его ждет транспортер AcrB , связывается с активным центром помпы и затем за счет энергии встречного движения протона выкачивается за пределы наружной мембраны бактерии.

Антиоксиданты направляются в митохондрию

Но решение, обходящее резистентность бактерий, можно считать, найдено — российскими учеными. В мае этого года в работе "Mitochondria-targeted antioxidants as highly effective antibiotics ", опубликованной в журнале Scientific Reports, коллектив авторов из МГУ впервые показал принципиально новый гибридный антибиотик широкого спектра действия — митохондриально направленный антиоксидант.

Митохондриально направленные антиоксиданты (МНА) получили широкое распространение не только как инструмент исследований роли митохондрий в разных физиологических процессах, но и как терапевтические средства. Это конъюгаты, то есть соединения, состоящие из какого-либо хорошо известного антиоксиданта (пластохинона, убихинона, витамина Е, ресвератрола) и проникающего, то есть способного преодолеть мембрану клетки или митохондрии, катиона (трифенилфосфония, родамина и др.).

Механизм действия МНА доподлинно не известен. Известно лишь, что в митохондрии они частично разобщают окислительное фосфорилирование, метаболический путь синтеза универсального клеточного горючего — аденозинтрифосфата, АТФ, что стимулирует клеточное дыхание и снижает мембранный потенциал и может приводить к защитному эффекту при окислительном стрессе.

Предположительно это выглядит так. МНА из-за своей липофильности (тяги к липидам или сродства с ними) связываются с мембраной митохондрии и постепенно мигрируют внутрь митохондрии, где, видимо, соединяются с отрицательно заряженным остатком жирной кислоты; составив комплекс, они теряют заряд и вновь оказываются снаружи мембраны митохондрии. Там остаток жирной кислоты захватывает протон, из-за чего комплекс распадается. Захватившая протон жирная кислота переносится в обратном направлении — и внутри митохондрии теряет протон, то есть, проще говоря, переносит его в митохондрию, отчего как раз и снижается мембранный потенциал.

Один из первых МНА был создан на основе трифенилфосфония в Оксфорде — английским биологом Майклом Мерфи; это был конъюгат с убихиноном (или коферментом Q , принимающим участие в окислительном фосфорилировании). Под названием MitoQ этот антиоксидант получил значительную известность как перспективный препарат для замедления старения кожи, а также как возможное средство защиты печени при гепатитах и жировом ее перерождении.

Позднее тем же путем пошла группа академика Владимира Скулачева из МГУ: на основе конъюгата трифенилфосфония с антиоксидантом пластохиноном (участвует в фотосинтезе) был создан эффективный SkQ1 .

В соответствии с симбиотической теорией происхождения митохондрий, выдвинутой членом-корреспондентом АН СССР Борисом Михайловичем Козо-Полянским в 1920-х годах и американским биологом Линн Маргулис в 1960-х годах, между митохондриями и бактериями — много общего, и можно ожидать, что МНА будут воздействовать на бактерии. Однако несмотря на очевидную схожесть бактерий и митохондрий и десятилетний опыт работы с МНА во всем мире никакие попытки обнаружить антимикробное действие МНА не приводили к положительным результатам.

Последний рубеж пал

Колистин считается антибиотиком последнего резерва — это старый препарат из класса полимиксинов, вышедший из употребления из-за своего токсического воздействия на почки. Когда обнаружились супербактерии, которые, кроме того что сами сопротивлялись известным антибиотикам, еще и обзавелись способностью передавать друг другу генную информацию, позволяющую сопротивляться антибиотикам, выяснилось, что во-первых, колистин губителен для всех этих бактерий, а во-вторых, бактерии не могут обмениваться генами резистентности к колистину, если вдруг таковая все-таки возникнет.

Увы, но в мае 2016 года в американское Хранилище мультирезистентных микроорганизмов, которое находится в структуре Исследовательского института имени Уолтера Рида (это структура армии США), поступила-таки бактерия, которая не просто была индифферентна к колистину, но еще и оказалась способна передавать генную информацию с этой резистентностью другим бактериям. Первый такой микроорганизм еще в 2015 году был зафиксирован в Китае, долгое время была надежда, что это единичный случай, но она не оправдалась. Особенно печально, что в США этим микроорганизмом оказалась всем хорошо знакомая кишечная палочка.

Загадка двух палочек

Прорыв случился в 2015 году: впервые антибактериальное действие МНА на примере SkQ1 было показано в работе "Разобщающее и токсическое действие алкил-трифенилфосфониевых катионов на митохондрии и бактерии Bacillus subtilis в зависимости от длины алкильного фрагмента" — ее опубликовал журнал "Биохимия" в декабре 2015 года. Но то было описанием феномена: эффект наблюдался при работе с сенной палочкой (Bacillus subtilis ) и не наблюдался при работе с палочкой кишечной (Escherichia coli ).

Но дальнейшие исследования, которые легли в основу новейшей работы, опубликованной в журнале Scientific Reports , показали, что МНА SkQ1 — высокоэффективный антибактериальный агент в отношении широкого спектра грамположительных бактерий. SkQ1 эффективно подавляет рост таких надоедливых бактерий, как золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus ) — один из четырех наиболее частых видов микроорганизмов, вызывающих внутрибольничные инфекции. Так же эффективно SkQ1 подавляет рост микобактерий, в том числе палочки Коха (Mycobacterium tuberculosis ). Более того, МНА SkQ1 оказался высокоэффективным средством против грамотрицательных бактерий, таких как Photobacterium phosphoreum и Rhodobacter sphaeroides .

И только в отношении кишечной палочки он был крайне неэффективен, а ведь именно Escherichia coli — та бактерия, которую микробиологи используют как модельный организм, что и было, по-видимому, причиной неудачных попыток ранее обнаружить антимикробное действие МНА.

Естественно, исключительная резистентность кишечной палочки вызвала весьма сильный интерес исследователей. К счастью, современная микробиология сделала большой шаг вперед в методологическом аспекте, и у ученых созданы целые коллекции микроорганизмов с делециями (отсутствием) некоторых генов, не вызывающими их гибель. Одна из таких коллекций — делеционных мутантов кишечной палочки — находится в распоряжении МГУ.

Исследователи высказали предположение, что резистентность может быть обусловлена работой какой-либо из помп множественной лекарственной устойчивости, имеющихся у кишечной палочки. Любая помпа плоха для инфицированного человека тем, что просто выбрасывает из бактериальной клетки антибиотик, он на нее не успевает подействовать.

Генов, отвечающих за действие помп множественной лекарственной устойчивости, у кишечной палочки много, и было решено начать анализ с продуктов генов, входящих в состав сразу нескольких помп,— а именно белка TolC .

Белок TolC — канал на внешней мембране грамотрицательных бактерий, он служит внешней частью для нескольких помп множественной лекарственной устойчивости.

Анализ делеционного мутанта (то есть палочки без белка TolC ) показал, что его резистентность снизилась на два порядка и стала неотличима от резистентности грамположительных бактерий и нерезистентных грамотрицательных бактерий. Таким образом, можно было заключить, что выдающаяся резистентность кишечной палочки — результат работы одной из помп множественной лекарственной устойчивости, имеющих в составе белок TolC . А дальнейший анализ делеционных мутантов по белкам — компонентам помп множественной лекарственной устойчивости показал, что только помпа AcrAB-TolC участвует в откачке SkQ1 .

Резистентность, вызванная наличием помпы AcrAB-TolC, не выглядит непреодолимой преградой: антиоксидантный конъюгат SkQ1 — также уникальное для этой помпы вещество, очевидно, можно будет найти для нее ингибитор.

В мае 2015 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) выдвинула Глобальный план действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам, признав бактериальное сопротивление антибиотикотерапии кризисом

Бессмертие Генриетты Лакс

Линия "бессмертных" клеток HeLa получила свое название по имени негритянки Генриетты Лакс (Henrietta Lacs). Клетки были получены из раковой опухоли ее шейки матки, без ее ведома и тем более согласия в феврале 1951 года Джорджем Гаем, врачом-исследователем питтсбургской университетской больницы имени Джона Хопкинса. Генриетта Лакс умерла в октябре того же года, а доктор Гай выделил одну конкретную клетку из эндотелия ее матки и начал с нее клеточную линию. Вскоре он обнаружил, что это уникально живучая культура, и начал делиться ею с исследователями по всему миру. Клетки, произошедшие от Генриетты Лакс, помогли человечеству при создании вакцины от полиомиелита, при определении числа хромосом в человеческой клетке (46), при первом клонировании человеческой клетки, наконец, при экспериментах с экстракорпоральным оплодотворением.

Надо сказать, что происхождение клеток Джордж Гай держал в тайне — оно стало известно только после его смерти.

Не только лечить, но и чинить

Но чтобы называться антибиотиком, SkQ1 необходимо соответствовать множеству критериев, таких как (1) способность подавлять жизненные процессы микроорганизмов в малых концентрациях и (2) мало повреждать или вовсе не повреждать клетки человека и животных. Сравнение SkQ1 c известными антибиотиками — канамицином, хлорамфениколом, ампициллином, ципрофлоксацином, ванкомицином и пр.— показало, что SkQ1 действует на бактерии в таких же, как они, или даже более низких концентрациях. Более того, при сравнительном исследовании действия SkQ1 на культуру клеток человека линии HeLa выяснилось, что в минимальной бактерицидной концентрации SkQ1 не оказывает практически никакого воздействия на клетки человека — а замечают клетки SkQ1 , когда концентрация антиоксидантного конъюгата становится более чем на порядок выше необходимой для бактерицидного действия.

Механизм действия SkQ1 на бактерии оказался подобен действию МНА на митохондрии, однако общее действие на прокариотическую и эукариотическую клетку различалось. Одна из главных причин — пространственное разделение процессов генерации энергии (исключая субстратное фосфорилирование) и процессов транспорта веществ внутрь клетки, что, по-видимому, представляет собой существенное эволюционное преимущество, которое часто обходят вниманием при рассмотрении выгод от сожительства протомитохондрии и протоэукариота. Так как у бактерий генерация энергии и транспорт локализованы на клеточной мембране, то падение потенциала вызывает, по-видимому, остановку сразу обоих процессов, что приводит к смерти микроорганизма. В эукариотической клетке процессы транспорта веществ внутрь клетки локализованы на клеточной мембране, а генерация энергии происходит в митохондриях, что позволяет эукариотической клетке выживать при летальных для бактерий концентрациях МНА. Кроме того, разность потенциала на мембране бактерии и эукариотической клетки различается в пользу бактерий — и это тот самый дополнительный фактор, аккумулирующий МНА на мембране бактерий.

Рассматривая механизм действия SkQ1 на бактерии, нельзя пройти мимо другого уникального свойства этого МНА — способности лечения поврежденных бактериями эукариотических клеток за счет антиоксидантных свойств. SkQ1 , действуя как антиоксидант, снижает уровень вредных активных форм кислорода, образующихся при воспалении, вызванном бактериальной инфекцией.

Таким образом, SkQ1 может быть признан уникальным гибридным антибиотиком широчайшего спектра действия. Дальнейшая разработка антибиотиков на его основе может позволить переломить ход войны человечества против все более совершенных микробов.

Павел Назаров, кандидат биологических наук, НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Со времен Дарвина известно, что мир - вековая арена борьбы за существование всего живого. Смерть рано или поздно губит все, что неспособно выдержать эту борьбу, эту конкуренцию с более совершенными, более приспособленными к жизни существами. Однако, пожалуй, сам Дарвин не подозревал, что и в мире, который находится за пределами человеческого зрения, среди мельчайших живых существ, среди микробов, бушует та же вековая борьба за существование. Но кто с кем борется? Какие виды оружия используются при этом? Кто оказывается побежденным и кто победителем?

На эти и подобные им вопросы ученые нашли ответы далеко не сразу. Долгое время в распоряжении исследователей были лишь отдельные разрозненные наблюдения.

Еще в 1869 году профессор Военно-медицинской академии Вячеслав Авксентьевич Манассеин заметил, что, если на питательной среде поселилась плесень, на ней никогда не растут бактерии. В то же время другой ученый, профессор Алексей Герасимович Полотебнев, использовал на практике наблюдение своего коллеги. Он успешно лечил гнойные раны повязками с зеленой плесенью, которую соскабливал с лимонных и апельсиновых корок.

Луи Пастер заметил, что обычно бациллы сибирской язвы хорошо растут на питательном бульоне, но, если в этот бульон попадут гнилостные бактерии, они начинают быстро размножаться и "забивают" бациллы сибирской язвы.

Илья Ильич Мечников установил, что гнилостные бактерии, в свою очередь, подавляются бактериями молочнокислыми, образующими вредную для них молочную кислоту.

Известно было и еще несколько фактов такого же рода. Этого оказалось достаточно, чтобы зародилась мысль использовать борьбу микроорганизмов друг с другом в целях лечения заболеваний. Но как? И каких?

Вот если бы заглянуть в жизнь микромира, рассмотреть, что делают микробы в естественной обстановке, а не в искусственно выращенной лабораторной культуре. Ведь в одном грамме почвы, взятой где-нибудь в лесу или на огороде, содержится несколько тысяч спор плесневых грибов, несколько сотен тысяч других грибов-актиномицетов, миллионы бактерий различных видов, не говоря об амебах, инфузориях и других животных.

И, конечно, в таких тесных сообществах микробы вступают в самые различные взаимоотношения друг с другом. Здесь могут наблюдаться и случаи взаимопомощи - симбиоза, и ожесточенная борьба представителей разных микробных видов, так называемый естественный антагонизм микробов, и просто безразличное отношение друг к другу.

Но как это увидеть?!

Киев. 1930 год. Опыт за опытом ставил доцент Киевского университета Николай Григорьевич Холодный, пытаясь найти "способ изучения микроорганизмов в их естественной обстановке". Такой способ им уже найден для микробов, обитающих в водной среде. Но как рассмотреть жизнь микробов в почве?

Собрав в окрестностях Киева образцы почв, Холодный по нескольку дней не выходит из своей лаборатории. К тому же университетская лаборатория - его дом. Квартира, где Николай Григорьевич жил раньше, была разрушена артиллерийским снарядом еще в 1919 году. С тех пор qh поселился в лаборатории. Равнодушный к материальным благам и удобствам жизни, он даже считает, что устроился неплохо: можно работать в любое время суток.

Сейчас Холодный уже известный исследователь железобактерий, "крестный" нескольких дотоле науке неведомых видов из рода Лептотрикс. Пройдет несколько лет, и две его статьи, "Почвенная камера, как метод исследования микрофлоры" и "Метод непосредственного изучения почвенной микрофлоры", положат начало новому направлению в микробиологии. "Войны микробов" в их естественном состоянии станут предметом прямого изучения. Но пока пробуется один прием за другим, опыт следует за опытом. Многое из найденного Холодного не удовлетворяет, сложно. Во всех своих методических разработках он ищет простоты. Способ должен быть таким, чтобы им легко мог воспользоваться любой исследователь. Вот, например, острым ножом ученый делает вертикальный разрез в почве и вставляет в него четырехугольное стерилизованное стеклышко, стекло закапывается. Со временем оно покрывается почвенными растворами, мелкими частичками почвы, среди которых поселятся обитающие в ней микроорганизмы. Теперь остается только извлечь стекло и после специальной обработки рассмотреть его под микроскопом. Приставшие к стеклу частички почвы и микробы сохраняются в их естественном расположении, и, таким образом, можно наблюдать отдельные "кадры" из грандиозного фильма о жизни микробов в почве. Проще, кажется, не придумаешь.

Действительно, это было то, что так упорно искал Холодный. Он видел, как мир микробов жил своей бурной и тайной жизнью. Ежесекундно здесь шла ожесточенная борьба, приводящая к смерти одних обитателей и усиленному размножению других.

Теперь уже ученые знают, каким оружием пользуются различные виды микробов в своих непрекращающихся "войнах". Это не обязательно прямое уничтожение, как делают амебы и инфузории с бактериями. Очень часто микробы применяют и другие методы воздействия на своих врагов. Винные дрожжи, например, выделяют спирт, а уксуснокислые бактерии - уксусную кислоту. Такое "химическое оружие" угнетает развитие большинства других видов микробов, являясь для них ядом. Это как бы оружие против всех, кто посмеет приблизиться.

Однако в арсенале некоторых микроорганизмов встречается и оружие "персонального" прицела. Оно направлено только против некоторых видов микробов, угнетает только их и не поражает все остальные микроорганизмы. Как правило, такие вещества вырабатываются специально для нападения и защиты против микробов, с которыми первым приходится чаще всего сталкиваться в своей жизни. Вещества эти получили название антибиотиков.

Особенно много антибиотиков вырабатывают почвенные микроорганизмы. Это и понятно - ведь в почве отдельные виды микробов образуют целые скопления. Создав вокруг такого "поселения" зону антибиотической защиты, микробы находятся за ней, как за крепостной стеной. Причем она служит им не только надежной защитой, но в какой-то степени даже средством наступления, так как по мере роста колонии "крепостные стены" раздвигаются и его обитатели расширяют свои владения. Кстати, отсюда понятно, почему не вырабатывают антибиотиков водные микроорганизмы. В воде крепости не создашь, да и соседи здесь непостоянные. Тут нужно оружие против всех, кто посмеет приблизиться, - допустим, какая-нибудь кислота.

Близкое знакомство с почвенной микрофлорой показало, что почвенных микробов-антагонистов очень много и большинство из них для решения основного вопроса борьбы за существование "жить или не жить" вырабатывает антибиотические вещества, убивающие врагов.

Многолетние систематические исследования советского ученого Николая Александровича Красильникова показали, что особенно широко распространены в почве различные виды плесневых грибов и так называемые лучистые грибы - актиномицеты. И те и другие вырабатывают антибиотики.

У них это, пожалуй, единственное средство защиты против бактерий, для которых грибы являются лакомой пищей. Кстати, сами бактерии тоже вырабатывают антибиотики, но уже против почвенных амеб и инфузорий, охотящихся за ними. Этот интересный факт был впервые установлен профессором Александром Александровичем Имшенецким.

Итак, казалось бы, все просто. Микробов, вырабатывающих антибиотики, много. Остается только отобрать у них это оружие, выделить его в чистом виде и применять как лекарство против болезнетворных бактерий. Но не тут-то было!

Действительно, антибиотиков много. Так, только из почвы Подмосковья в лаборатории профессора Георгия Францевича Гаузе было выделено в чистую культуру. 556 штаммов почвенных грибов, 234 из них оказались продуцентами самых разных антибиотиков. Большая часть штаммов (56 процентов) вырабатывала противобактериальные антибиотики; 23 процента были универсалы: их антибиотики подавляли и рост бактерий и рост других грибов; остальные владели оружием лишь против своих собратьев - грибов иных видов.

Богатый набор продуцентов антибиотиков имеет и почва других мест. Однако здесь повторяется история с "магической пулей" Эрлиха: антибиотики оказываются токсичными не только для возбудителей болезней, но и для организма человека.

С одной стороны, в природе великое множество антибиотиков, но использовать в качестве лекарственных препаратов можно лишь считанные единицы. Впрочем, это стало известно уже после того, как в поиски новых средств борьбы с болезнетворными микробами вмешался случай. И хотя ученые в своей работе на случай никогда не рассчитывают, а гипотезы и пути исследований строятся, исходя из уже известных закономерностей, в истории науки можно найти немало примеров, когда дальнейшее развитие определяла счастливая случайность. Но случай не слеп. "Судьба, - как сказал Пастер, - одаривает только подготовленные умы".

Так было и на этот раз.

Вирусы и бактерии – великое противостояние

Создание современной технологии геномного редактирования, которая уже с успехом применяется на разных животных, растениях, грибах и бактериях, базируется на исследованиях бактериальных систем CRISPR-Cas. Изначально предполагалось, что они участвуют в ликвидации повреждений бактериальной ДНК, но в 2007 г. стало ясно, что истинное предназначение этих систем – борьба с вирусами бактерий, бактериофагами. Всего за девять лет наука проделала гигантский путь от раскрытия механизма бактериального иммунитета до редактирования геномов людей – в настоящее время уже проводятся первые эксперименты по редактированию ДНК человеческих эмбрионов. У бактерий имеются и другие «иммунные» механизмы, изучение которых, возможно, создаст предпосылки для новых прорывов в биомедицине

Бактериофаги – это вирусы, которые поражают только бактерий. В ходе инфекции они влияют на все процессы жизнедеятельности бактериальной клетки, фактически превращая ее в фабрику по производству вирусного потомства. В конце концов клетка разрушается, а вновь образованные вирусные частицы выходят наружу и могут заражать новые бактерии.

Несмотря на огромное число и разнообразие природных фагов, встречаемся мы с ними редко. Однако бывают ситуации, когда деятельность этих вирусов не остается незамеченной. Например, на предприятиях, где производят сыры, йогурты и другие молочно-кислые продукты, часто приходится сталкиваться с вирусной атакой на бактерии, сбраживающие молоко. В большинстве таких случаев фаговая инфекция распространяется молниеносно, и полезные бактерии гибнут, что приводит к значительным экономическим потерям (Neve et al. , 1994).

Именно благодаря прикладным исследованиям в интересах молочной промышленности, направленным на получение устойчивых к бактериофагам штаммов молочно-кислых бактерий, был открыт ряд механизмов, с помощью которых бактерии избегают инфекции. Параллельно были изу­чены способы, с помощью которых вирусы, в свою очередь, преодолевают бактериальные системы защиты (Moineau et al. , 1993).

Кто защищен – тот вооружен

На сегодня известно пять основных, весьма хитроумных механизмов защиты, которые бактерии выработали в непрестанной борьбе с вирусами: изменение рецептора на поверхности клетки; исключение суперинфекции; системы абортивной инфекции; системы рестрикции-модификации и, наконец, системы CRISPR-Cas.

В ходе эволюции происходила и сейчас происходит селекция бактерий, способных избежать гибели при инфицировании вирусами, что, в свою очередь, служит стимулом для бактериофагов совершенствовать свои агрессивные стратегии. Эта «гонка вооружений», длящаяся несколько миллиардов лет, т. е. ровно столько, сколько существуют сами бактерии и их враги, породила целый ряд изощренных механизмов защиты и нападения

Вирусная атака начинается с прикрепления фага к специфическому рецептору на поверхности бактериальной клетки, но при потере рецептора или изменении в его структуре связывания вируса не происходит. Бактерии могут менять рецепторы в зависимости от окружающих условий, таких как плотность и разнообразие микроорганизмов в среде, а также доступность питательных веществ (Bikard et al. , 2012). Любопытный пример - ​бактерии вида Vibrio anguillarum , которые способны формировать биопленку , т. е. плотный слой клеток, прикрепленный к какой-либо поверхности. У этой бактерии имеется своего рода «чувство кворума», за счет чего при увеличении плотности клеток у них понижается выработка рецептора, с которым может связываться вирус. В результате биопленка становится почти полностью устойчивой к заражению (Tan et al. , 2015).

Однако потеря рецепторов не всегда выгодна для бактерии, поскольку они выполняют разнообразные важные функции, например, транспорт питательных веществ или формирование межклеточных контактов (Lopez-Pascua et al. , 2008). В результате для каждой пары «бактерия-бактериофаг» в ходе эволюции находится оптимальное решение, обеспечивающее приемлемый уровень защиты при сохранении возможности роста бактерий в различных условиях среды.

Следующий защитный механизм – исключение супер­инфекции . Для бактериофагов известны два основных пути инфекции: литический , приводящий к быстрой гибели зараженной бактерии с высвобождением вирусного потомства, и затяжной лизогенный путь, когда наследственный материал вируса находится внутри генома бактерии, удваивается только с хозяйской ДНК, не причиняя клетке вреда. Когда клетка находится в состоянии лизогенной инфекции, то, с точки зрения «домашнего» вируса (профага ), ее заражение другим вирусом нежелательно.

Действительно, многие вирусы, встроившие свою ДНК в геном клетки, ограничивают вновь проникшего в клетку бактериофага («суперинфекцию») посредством специальных белков-репрессоров, не позволяющих генам «пришельца» работать (Calendar, 2006). А некоторые фаги даже препятствуют другим вирусным частицам проникнуть в инфицированную ими клетку, воздействуя на ее рецепторы. В результате бактерии – носительницы вируса имеют очевидное преимущество по сравнению с незараженными собратьями.

В 1978 г. за открытие ферментов рестриктаз швейцарский генетик В. Арбер и американские микробиологи Д. Натанс и Г. Смит были удостоены Нобелевской премии. Изучение систем рестрикции-модификации привело к созданию технологии молекулярного клонирования, которая широко применяется во всем мире. С помощью рестриктаз можно «вырезать» гены из генома одного организма и вставить в геном другого, получив химерную рекомбинантную ДНК, не существующую в природе. Различные вариации этого подхода используются учеными для изолирования отдельных генов и их дальнейшего изучения. Кроме того, он широко применяется в фармацевтике, например, для наработки инсулина или терапевтических антител: все лекарства такого рода созданы с помощью молекулярного клонирования, т. е. являются продуктом генной модификации

Во время инфекции все ресурсы бактериальной клетки направлены на производство новых вирусных частиц. Если рядом с такой клеткой будут находиться другие уязвимые бактерии, то инфекция быстро распространится и приведет к гибели большинства из них. Однако для таких случаев у бактерии имеются так называемые системы абортивной инфекции , которые приводят ее к запрограммированной гибели. Конечно, этот «альтруистичный» механизм не спасет саму зараженную клетку, но остановит распространение вирусной инфекции, что выгодно для всей популяции. Бактериальные системы абортивной инфекции очень разнообразны, но детали их функционирования пока изучены недостаточно.

К средствам противовирусной защиты бактерий относятся и системы рестрикции-модификации , в которые входят гены, кодирующие два белка-фермента – рестриктазу и метилазу . Рестриктаза узнает определенные последовательности ДНК длиной 4-6 нуклеотидов и вносит в них двуцепочечные разрывы. Метилаза, напротив, ковалентно модифицирует эти последовательности, добавляя к отдельным нуклеотидным основаниям метильные группы, что предотвращает их узнавание рестриктазой.

В ДНК бактерии, содержащей такую систему, все сайты модифицированы. И если бактерия заражается вирусом, ДНК которого не содержит подобной модификации, рестриктаза защитит от инфекции, разрушив вирусную ДНК. Многие вирусы «борются» с системами рестрикции-модификации, не используя в своих геномах последовательности, узнаваемые рестриктазой, – очевидно, что вирусные варианты с другой стратегией просто не оставили потомства.

Последней и в настоящее время самой интересной системой бактериального иммунитета является система CRISPR-Cas, с помощью которой бактерии способны «записывать» в собственный геном и передавать потомству информацию о фагах, с которыми они сталкивались в течение жизни. Наличие таких «воспоминаний» позволяет распознавать ДНК фага и эффективней противостоять ему при повторных инфекциях. В настоящее время к системам CRISPR-Cas приковано пристальное внимание, так как они стали основой революционной технологии редактирования геномов, которая в будущем, возможно, позволит лечить генетические заболевания и создавать новые породы и сорта сельскохозяйственных животных и растений.

Врага нужно знать в лицо

Системы CRISPR-Cas являются уникальным примером адаптивного иммунитета бактерий. При проникновении в клетку ДНК фага специальные белки Cas встраивают фрагменты вирусной ДНК длиной 25-40 нуклеотидов в определенный участок генома бактерии (Barrangou et al. , 2007). Такие фрагменты называются спейсерами (от англ. spacer – промежуток), участок, где происходит встраивание, – CRISPR-кассета (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ), а сам процесс приобретения спейсеров – ​адаптацией .

Чтобы использовать спейсеры в борьбе с фаговой инфекцией, в клетке должен происходить еще один процесс, управляемый белками Cas, названный интерференцией . Суть его в том, что в ходе транскрипции CRISPR-кассеты образуется длинная молекула РНК, которая разрезается белками Cas на короткие фрагменты – защитные криспрРНК (крРНК), каждая из которых содержит один спейсер. Белки Cas вместе с молекулой крРНК образуют эффекторный комплекс , который сканирует всю ДНК клетки на наличие последовательностей, идентичных спейсеру (протоспейсеров ). Найденные протоспейсеры расщепляются белками Cas (Westra et al. , 2012; Jinek et al. , 2012).

Системы CRISPR-Cas обнаружены у большинства прокариот – бактерий и архей. Хотя общий принцип действия всех известных систем CRISPR-Cas одинаков, механизмы их работы могут существенно отличаться в деталях. Наибольшие различия проявляются в строе­нии и функционировании эффекторного комплекса, в связи с чем системы CRISPR-Cas делят на несколько типов. На сегодняшний день описаны шесть типов таких неродственных друг другу систем (Makarova et al. , 2015; Shmakov et al. , 2015).

Наиболее изученной является система CRISPR-Cas I типа, которой обладает излюбленный объект молекулярно-биологических исследований – бактерия кишечная палочка (Esсherichia coli ). Эффекторный комплекс в этой системе состоит из нескольких небольших белков Cas, каждый из которых отвечает за разные функции: разрезание длинной некодирующей CRISPR РНК, связывание коротких крРНК, поиск, а затем разрезание ДНК-мишени.

В системах II типа эффекторный комплекс образован единственным большим белком Cas9, который в одиночку справляется со всеми задачами. Именно простота и относительная компактность таких систем послужили основой для разработки технологии редактирования ДНК. Согласно этому методу, в клетки эукариот (например, человека) доставляют бактериальный белок Сas9 и крРНК, которую называют гидовой (гРНК). Вместо спейсера вирусного происхождения такая гРНК содержит целевую последовательность, соответствующую интересному для исследователя участку генома, например, где есть мутация, вызывающая какую-то болезнь. Получить же гРНК «на любой вкус» совсем несложно.

Эффекторный комплекс Cas9-гРНК вносит двуцепочечный разрыв в последовательность ДНК, точно соответствующую «гидовой» РНК. Если вместе с Cas9 и гРНК внести в клетку и последовательность ДНК, не содержащую мутацию, то место разрыва будет восстановлено по матрице «правильной» копии! Таким образом, используя разные гРНК, можно исправлять нежелательные мутации или вводить направленные изменения в гены-мишени. Высокая точность программируемого узнавания мишеней комплексом Cas9-гРНК и простота метода привели к лавинообразному росту работ по редактированию геномов клеток животных и растений (Jiang & Marraffini, 2015).

Гонка вооружений

В ходе эволюции бактерии и бактериофаги выработали ряд приспособлений, которые должны обеспечить каждому из участников «гонки вооружений» преимущество в борьбе с противником или возможность уклониться от его атаки.

Бактериофаги, как факторы среды, вызывают направленные изменения в геноме бактерий, которые наследуются и дают бактериям явное преимущество, спасая от повторных инфекций. Поэтому системы CRISPR-Cas можно считать примером ламарковской эволюции, при которой происходит наследование благоприобретенных признаков (Koonin et al. , 2009)

Что касается систем CRISPR-Cas, то если фаг обзаведется мутацией в протоспейсере, эффективность его узнавания эффекторным комплексом снижается, и фаг получает возможность заразить клетку. Но и бактерия не оставит без внимания такую попытку ускользнуть от CRISPR-Cas: в качестве ответной реакции она начинает с резко возросшей эффективностью приобретать новые дополнительные спейсеры из ДНК уже «знакомого» фага, пусть и мутировавшего. Такое явление, названное праймированной адаптацией, многократно повышает эффективность защитного действия систем CRISPR-Cas (Datsenko et al. , 2012).

Некоторые бактериофаги реагируют на наличие в бактериальной клетке систем CRISPR-Cas выработкой особых анти CRISPR-белков, способных связываться с белками Cas и блокировать их функции (Bondy-Denomy et al. , 2015). Еще одно ухищрение - обмен участков генома вируса, на которые нацелена система CRISPR-Cas, на участки геномов родственных вирусов, отличающихся по составу нуклеотидной последовательности (Paez-Espino et al. , 2015).

Результаты работ нашей лаборатории свидетельствуют, что зараженные клетки на самом деле погибают даже при наличии защиты CRISPR-Cas, но при этом они ограничивают численность вирусного потомства. Поэтому CRISPR-Cas правильнее относить к системам абортивной инфекции, а не к «настоящим» иммунным системам.

Благодаря постоянному совершенствованию биоинформатических алгоритмов поиска, а также включению в анализ все большего количества прокариотических геномов, открытие новых типов CRISPR-Cas систем является делом недалекого будущего. Предстоит также выяснить и детальные механизмы работы многих недавно открытых систем. Так, в статье, опубликованной в 2016 г. в журнале Science и посвященной анализу системы CRISPR-Cas VI типа, описан белок С2с2, образующий эффекторный комплекс с крРНК, который нацелен на деградацию не ДНК, а РНК (Abudayyeh et al. , 2016). В будущем такое необычное свойство может быть использовано в медицине для регулирования активности генов путем изменения количества кодируемых ими РНК.

Изучение стратегий борьбы бактерий с бактериофагами, несмотря на свою кажущуюся фундаментальность и отвлеченность от задач практической медицины, принесло неоценимую пользу человечеству. Примерами этого могут служить методы молекулярного клонирования и редактирования геномов – направленного внесения или удаления мутаций и изменения уровня транскрипции определенных генов.

Благодаря быстрому развитию методов молекулярной биологии всего лишь через несколько лет после открытия механизма действия систем CRISPR-Cas была создана работающая технология геномного редактирования, способная бороться с болезнями, ранее считавшимися неизлечимыми. Доступность и простота этой технологии позволяют рассматривать ее как основу для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и биотехнологий будущего, которые будут базироваться на направленных и безопасных генных модификациях.

Нет никаких сомнений, что дальнейшее изучение взаимодействия бактерий и их вирусов может открыть перед нами такие возможности, о которых мы сейчас даже не подозреваем.

Литература

Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Konermann S. et al. C 2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector // Science. 2016. V. 353: aaf5573.

Barrangou R., Fremaux C., Deveau H. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. V. 315. P. 1709–1712.

Bikard D., Marraffini L. A. Innate and adaptive immunity in bacteria: mechanisms of programmed genetic variation to fight bacteriophages // Curr. Opin. Immunol. 2012. V. 1 P. 15–20.

Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S. et al. Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins // Nature. 2015. V. 526. P. 136–139.

Calendar R., Abedon S. T. The Bacteriophages // 2nd Ed., Oxford University Press. 2006.

Datsenko K. A., Pougach K., Tikhonov A. et al. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 945

Jiang W., Marraffini L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems // Annu. Rev. Microbiol. 2015. V. 69. P. 209–28.

Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. V. 337. P. 816–821.

Koonin E. V., Wolf Y. I. Is evolution Darwinian or/and Lamarckian? // Biol. Direct. 2009. V. 4. P. 42.

Lopez-Pascua L., Buckling A. Increasing productivity accelerates host-parasite coevolution // J. Evol. Biol. 2008. V. 3. P. 853–860.

Makarova K. S., Wolf Y. I., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems // Nat. Rev. Microbiol. 2015. V. 11. P. 722–736.

Moineau, S., Pandian S., Klaenhammer T. R. Restriction/modification systems and restriction endonucleases are more effective on lactococcal bacteriophages that have emerged recently in the dairy industry // Appl. Envir. Microbiol. 1993. V. 59. P. 197–202.

Neve H., Kemper U., et al. Monitoring and characterization of lactococcal bacteriophage in a dairy plant // Kiel. Milckwirtsch. Forschungsber. 1994. V. 46. P. 167–178.

Nuñez J. K., Harrington L. B., et al. Foreign DNA capture during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015a. V. 527. P. 535–538.

Nuñez J. K., Kranzusch P. J., et al. Cas1-Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nat. Struct. Mol. Biol. 2014. V. 21. P. 528–534.

Nuñez J. K., Lee A. S., Engelman A., Doudna J. A. Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR-Cas adaptive immunity // Nature. 2015b. V. 519. P. 193–198.

Paez-Espino D., Sharon I., et al. CRISPR Immunity Drives Rapid Phage Genome Evolution in Streptococcus thermophilus // MBio. 2015. V. 6: e00262–15.

Shmakov S., Abudayyeh O. O., Makarova K. S., et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. // Mol. Cell. 2015. V. 60. P. 385–397

Tan D., Svenningsen S. L., Middelboe M. Quorum sensing determines the choice of antiphage defense strategy in Vibrio anguillarum. // mBio 2015. V. 6: e00627–15.

Westra E. R., van Erp P. B., Künne T., et al. CRISPR immunity relies on the consecutive binding and degradation of negatively supercoiled invader DNA by Cascade and Cas3 // Mol. Cell. 2012. V. 46. P. 595–605.

Кирилл Стасевич, биолог

То, что антибиотики неэффективны против вирусов, уже давно стало азбучной истиной. Однако, как показывают опросы, 46% наших соотечественников полагают, что вирусы можно убить антибиотиками. Причина заблуждения, вероятно, кроется в том, что антибиотики прописывают при инфекционных заболеваниях, а инфекции привычно ассоциируются с бактериями или вирусами. Хотя стоит заметить, что одними лишь бактериями и вирусами набор инфекционных агентов не ограничивается. Вообще, антибиотиков великое множество, классифицировать их можно по разным медицинским и биологическим критериям: химическому строению, эффективности, способности действовать на разные виды бактерий или только на какую-то узкую группу (например, антибиотики, нацеленные на возбудителя туберкулёза). Но главное объединяющее их свойство - способность подавлять рост микроорганизмов и вызывать их гибель. Чтобы понять, почему антибиотики не действуют на вирусы, надо разобраться, как они работают.

На клеточную стенку действуют бета-лактамные антибиотики, к которым относятся пенициллины, цефалоспорины и другие; полимиксины нарушают целостность мембраны бактериальной клетки.

Клеточная стенка бактерий состоит из гетерополимерных нитей, сшитых между собой короткими пептидными мостиками.

Действие пенициллина на кишечную палочку: из-за пенициллина растущая бактериальная клетка не может достраивать клеточную стенку, которая перестаёт покрывать клетку целиком, в результате чего клеточная мембрана начинает выпячиваться и рваться.

У многих вирусов кроме генома в виде ДНК или РНК и белкового капсида есть ещё дополнительная оболочка, или суперкапсид, которая состоит из фрагментов хозяйских клеточных мембран (фосфолипидов и белков) и удерживает на себе вирусные гликопротеины.

Какие слабые места антибиотики находят у бактерий?

Во-первых, клеточная стенка. Любой клетке нужна какая-то граница между ней и внешней средой - без этого и клетки-то никакой не будет. Обычно границей служит плазматическая мембрана - двойной слой липидов с белками, которые плавают в этой полужидкой поверхности. Но бактерии пошли дальше: они кроме клеточной мембраны создали так называемую клеточную стенку - довольно мощное сооружение и к тому же весьма сложное по химическому строению. Для формирования клеточной стенки бактерии используют ряд ферментов, и если этот процесс нарушить, бактерия с большой вероятностью погибнет. (Клеточная стенка есть также у грибов, водорослей и высших растений, но у них она создаётся на другой химической основе.)

Во-вторых, бактериям, как и всем живым существам, надо размножаться, а для этого нужно озаботиться второй копией

наследственной молекулы ДНК, которую можно было бы отдать клетке-потомку. Над этой второй копией работают специальные белки, отвечающие за репликацию, то есть за удвоение ДНК. Для синтеза ДНК нужен «стройматериал», то есть азотистые основания, из которых ДНК состоит и которые складываются в ней в «слова» генетического кода. Синтезом оснований-кирпичиков опять же занимаются специализированные белки.

Третья мишень антибиотиков - это трансляция, или биосинтез белка. Известно, что ДНК хорошо подходит для хранения наследственной информации, но вот считывать с неё информацию для синтеза белка не очень удобно. Поэтому между ДНК и белками существует посредник - матричная РНК. Сначала с ДНК снимается РНК-копия, - этот процесс называется транскрипцией, а потом на РНК происходит синтез белка. Выполняют его рибосомы, представляющие собой сложные и большие комплексы из белков и специальных молекул РНК, а также ряд белков, помогающих рибосомам справляться с их задачей.

Большинство антибиотиков в борьбе с бактериями «атакуют» одну из этих трёх главных мишеней - клеточную стенку, синтез ДНК и синтез белка в бактериях.

Например, клеточная стенка бактерий - мишень для хорошо известного антибиотика пенициллина: он блокирует ферменты, с помощью которых бактерия осуществляет строительство своей внешней оболочки. Если применить эритромицин, гентамицин или тетрациклин, то бактерии перестанут синтезировать белки. Эти антибиотики связываются с рибосомами так, что трансляция прекращается (хотя конкретные способы подействовать на рибосому и синтез белка у эритромицина, гентамицина и тетрациклина разные). Хинолоны подавляют работу бактериальных белков, которые нужны для распутывания нитей ДНК; без этого ДНК невозможно правильно копировать (или реплицировать), а ошибки копирования ведут к гибели бактерий. Сульфаниламидные препараты нарушают синтез веществ, необходимых для производства нуклеотидов, из которых состоит ДНК, так что бактерии опять-таки лишаются возможности воспроизводить свой геном.

Почему же антибиотики не действуют на вирусы?

Во-первых, вспомним, что вирус - это, грубо говоря, белковая капсула с нуклеиновой кислотой внутри. Она несёт в себе наследственную информацию в виде нескольких генов, которые защищены от внешней среды белками вирусной оболочки. Во-вторых, для размножения вирусы выбрали особенную стратегию. Каждый из них стремится создать как можно больше новых вирусных частиц, которые будут снабжены копиями генетической молекулы «родительской» частицы. Словосочетание «генетическая молекула» использовано не случайно, так как среди молекул-хранительниц генетического материала у вирусов можно найти не только ДНК, но и РНК, причём и та и другая могут быть у них как одно-, так и двухцепочечными. Но так или иначе вирусам, как и бактериям, как и вообще всем живым существам, для начала нужно свою генетическую молекулу размножить. Вот для этого вирус пробирается в клетку.

Что он там делает? Заставляет молекулярную машину клетки обслуживать его, вируса, генетический материал. То есть клеточные молекулы и надмолекулярные комплексы, все эти рибосомы, ферменты синтеза нуклеиновых кислот и т. д. начинают копировать вирусный геном и синтезировать вирусные белки. Не будем вдаваться в подробности, как именно разные вирусы проникают в клетку, что за процессы происходят с их ДНК или РНК и как идёт сборка вирусных частиц. Важно, что вирусы зависят от клеточных молекулярных машин и особенно - от белоксинтезирующего «конвейера». Бактерии, даже если проникают в клетку, свои белки и нуклеиновые кислоты синтезируют себе сами.

Что произойдёт, если к клеткам с вирусной инфекцией добавить, например, антибиотик, прерывающий процесс образования клеточной стенки? Никакой клеточной стенки у вирусов нет. И потому антибиотик, который действует на синтез клеточной стенки, ничего вирусу не сделает. Ну а если добавить антибиотик, который подавляет процесс биосинтеза белка? Всё равно не подействует, потому что антибиотик будет искать бактериальную рибосому, а в животной клетке (в том числе человеческой) такой нет, у неё рибосома другая. В том, что белки и белковые комплексы, которые выполняют одни и те же функции, у разных организмов различаются по структуре, ничего необычного нет. Живые организмы должны синтезировать белок, синтезировать РНК, реплицировать свою ДНК, избавляться от мутаций. Эти процессы идут у всех трёх доменов жизни: у архей, у бактерий и у эукариот (к которым относятся и животные, и растения, и грибы), - и задействованы в них схожие молекулы и надмолекулярные комплексы. Схожие - но не одинаковые. Например, рибосомы бактерий отличаются по структуре от рибосом эукариот из-за того, что рибосомная РНК немного по-разному выглядит у тех и других. Такая непохожесть и мешает антибактериальным антибиотикам влиять на молекулярные механизмы эукариот. Это можно сравнить с разными моделями автомобилей: любой из них довезёт вас до места, но конструкция двигателя может у них отличаться и запчасти к ним нужны разные. В случае с рибосомами таких различий достаточно, чтобы антибиотики смогли подействовать только на бактерию.

До какой степени может проявляться специализация антибиотиков? Вообще, антибиотики изначально - это вовсе не искусственные вещества, созданные химиками. Антибиотики - это химическое оружие, которое грибы и бактерии издавна используют друг против друга, чтобы избавляться от конкурентов, претендующих на те же ресурсы окружающей среды. Лишь потом к ним добавились соединения вроде вышеупомянутых сульфаниламидов и хинолонов. Знаменитый пенициллин получили когда-то из грибов рода пенициллиум, а бактерии стрептомицеты синтезируют целый спектр антибиотиков как против бактерий, так и против других грибов. Причём стрептомицеты до сих пор служат источником новых лекарств: не так давно исследователи из Северо-Восточного университета (США) сообщили о новой группе антибиотиков, которые были получены из бактерий Streptomyces hawaiensi, - эти новые средства действуют даже на те бактериальные клетки, которые находятся в состоянии покоя и потому не чувствуют действия обычных лекарств. Грибам и бактериям приходится воевать с каким-то определённым противником, кроме того, необходимо, чтобы их химическое оружие было безопасно для того, кто его использует. Потому-то среди антибиотиков одни обладают самой широкой антимикробной активностью, а другие срабатывают лишь против отдельных групп микроорганизмов, пусть и довольно обширных (как, например, полимиксины, действующие только на грамотрицательные бактерии).

Более того, существуют антибиотики, которые вредят именно эукариотическим клеткам, но совершенно безвредны для бактерий. Например, стрептомицеты синтезируют циклогексимид, который подавляет работу исключительно эукариотических рибосом, и они же производят антибиотики, подавляющие рост раковых клеток. Механизм действия этих противораковых средств может быть разным: они могут встраиваться в клеточную ДНК и мешать синтезировать РНК и новые молекулы ДНК, могут ингибировать работу ферментов, работающих с ДНК, и т. д., - но эффект от них один: раковая клетка перестаёт делиться и погибает.

Возникает вопрос: если вирусы пользуются клеточными молекулярными машинами, то нельзя ли избавиться от вирусов, подействовав на молекулярные процессы в заражённых ими клетках? Но тогда нужно быть уверенными в том, что лекарство попадёт именно в заражённую клетку и минует здоровую. А эта задача весьма нетривиальна: надо научить лекарство отличать заражённые клетки от незаражённых. Похожую проблему пытаются решить (и небезуспешно) в отношении опухолевых клеток: хитроумные технологии, в том числе и с приставкой нано-, разрабатываются для того, чтобы обеспечить адресную доставку лекарств именно в опухоль.

Что же до вирусов, то с ними лучше бороться, используя специфические особенности их биологии. Вирусу можно помешать собраться в частицу, или, например, помешать выйти наружу и тем самым предотвратить заражение соседних клеток (таков механизм работы противовирусного средства занамивира), или, наоборот, помешать ему высвободить свой генетический материал в клеточную цитоплазму (так работает римантадин), или вообще запретить ему взаимодействовать с клеткой.

Вирусы не во всём полагаются на клеточные ферменты. Для синтеза ДНК или РНК они используют собственные белки-полимеразы, которые отличаются от клеточных белков и которые зашифрованы в вирусном геноме. Кроме того, такие вирусные белки могут входить в состав готовой вирусной частицы. И антивирусное вещество может действовать как раз на такие сугубо вирусные белки: например, ацикловир подавляет работу ДНК-полимеразы вируса герпеса. Этот фермент строит молекулу ДНК из молекул-мономеров нуклеотидов, и без него вирус не может умножить свою ДНК. Ацикловир так модифицирует молекулы-мономеры, что они выводят из строя ДНК-полимеразу. Многие РНК-вирусы, в том числе и вирус СПИДа, приходят в клетку со своей РНК и первым делом синтезируют на данной РНК молекулу ДНК, для чего опять же нужен особый белок, называемый обратной транскриптазой. И ряд противовирусных препаратов помогают ослабить вирусную инфекцию, действуя именно на этот специфический белок. На клеточные же молекулы такие противовирусные лекарства не действуют. Ну и наконец, избавить организм от вируса можно, просто активировав иммунитет, который достаточно эффективно опознаёт вирусы и заражённые вирусами клетки.

Итак, антибактериальные антибиотики не помогут нам против вирусов просто потому, что вирусы организованы в принципе иначе, чем бактерии. Мы не можем подействовать ни на вирусную клеточную стенку, ни на рибосомы, потому что у вирусов ни того, ни другого нет. Мы можем лишь подавить работу некоторых вирусных белков и прервать специфические процессы в жизненном цикле вирусов, однако для этого нужны особые вещества, действующие иначе, нежели антибактериальные антибиотики.

Очевидно, различия между бактериальными и эукариотическими молекулами и молекулярными комплексами, участвующими в одних и тех же процессах, для ряда антибиотиков не так уж велики и они могут действовать как на те, так и на другие. Однако это вовсе не значит, что такие вещества могут быть эффективны против вирусов. Тут важно понять, что в случае с вирусами складываются воедино сразу несколько особенностей их биологии и антибиотик против такой суммы обстоятельств оказывается бессилен.

И второе уточнение, вытекающее из первого: может ли такая «неразборчивость» или, лучше сказать, широкая специализация антибиотиков лежать в основе побочных эффектов от них? На самом деле такие эффекты возникают не столько оттого, что антибиотики действуют на человека так же, как на бактерии, сколько оттого, что у антибиотиков обнаруживаются новые, неожиданные свойства, с их основной работой никак не связанные. Например, пенициллин и некоторые другие бета-лактамные антибиотики плохо действует на нейроны - а всё потому, что они похожи на молекулу ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты), одного из основных нейромедиаторов. Нейромедиа-торы нужны для связи между нейронами, и добавка антибиотиков может привести к нежелательным эффектам, как если бы в нервной системе образовался избыток этих самых нейромедиаторов. В частности, некоторые из антибиотиков, как считается, могут провоцировать эпилептические припадки. Вообще, очень многие антибиотики взаимодействуют с нервными клетками, и часто такое взаимодействие приводит к негативному эффекту. И одними лишь нервными клетками дело не ограничивается: антибиотик неомицин, например, если попадает в кровь, сильно вредит почкам (к счастью, он почти не всасывается из желудочно-кишечного тракта, так что при приёме перорально, то есть через рот, не наносит никакого ущерба, кроме как кишечным бактериям).

Впрочем, главный побочный эффект от антибиотиков связан как раз с тем, что они вредят мирной желудочно-кишечной микрофлоре. Антибиотики обычно не различают, кто перед ними, мирный симбионт или патогенная бактерия, и убивают всех, кто попадётся на пути. А ведь роль кишечных бактерий трудно переоценить: без них мы бы с трудом переваривали пищу, они поддерживают здоровый обмен веществ, помогают в настройке иммунитета и делают много чего ещё, - функции кишечной микрофлоры исследователи изучают до сих пор. Можно себе представить, как чувствует себя организм, лишённый компаньонов-сожителей из-за лекарственной атаки. Поэтому часто, прописывая сильный антибиотик или интенсивный антибиотический курс, врачи заодно рекомендуют принимать препараты, которые поддерживают нормальную микрофлору в пищеварительном тракте пациента.