Quorum sensing или социальное поведение бактерий. Коммуникативные сигналы бактерий. Ингибиторы QS, вырабатываемые высшими растениями

2.1. Общая характеристика и механизм кворум сенсинга

Система межклеточной коммуникации у микроорганизмов носит название системы quorum sensing (QS ). Сегодня система QS определяется как система координированной экспрессии генов в популяции, зависящая от показателя её плотности, с использованием малых сигнальных молекул. Как уже отмечалось выше, этот механизм был впервые описан в 1970 году Нильсоном у морской бактерии Vibrio fisheri в качестве системы регуляции биолюминисценции. Изначально предполагалось, что данный механизм регуляции свойственен лишь небольшому числу близкородственных видов рода Vibrio , однако дальнейшие исследования показали широкую распространённость этого механизма регуляции в мире микроорганизмов . Было обнаружено, что с помощью системы QS микроорганизмы способны регулировать многие процессы жизнедеятельности, в частности патогенность, вторичный метаболизм, формирование биоплёнки и многое другое. Было показано, что система QS встречается не только у бактерий, но и у некоторых низших эукариот, таких как дрожжеподобные грибы родов Candida и Cryptococcus . Более того, оказалось, что с помощью этой системы микроорганизмы способны взаимодействовать не только с себе подобными, но и осуществлять межцарственную коммуникацию, в том числе и с высшими эукариотами.

В общем случае функционирование системы QS базируется на ряде ключевых принципов (рис. 1):

1. 
   Использование малых сигнальных молекул – в системе QS передача сигнала от одной клетке к другой осуществляется с помощью сигнальных молекул различной химической природы.
2. 
   Наличие специфических рецепторов – сигнальные молекулы не влияют на экспрессию генов-мишеней на прямую. Активация генов-мишеней происходит лишь после связывания сигнальных молекул с соответствующими рецепторами.
3. 
   Влияние плотности популяции клеток – запуск системы QS осуществляется лишь по достижении определённого значения плотности популяции клеток, коррелирующей с концентрацией сигнальных молекул во внешней среде.
4. 
   Самоподдержание функционирования – контроль синтеза новых сигнальных молекул и рецепторов осуществляется так же, как и генов- мишеней в отсутствии активации систем репрессии.
5. 
   Наличие механизмов избирательной негативной регуляции – в клетках микроорганизмов имеются как зависимые, так и не зависимые от QS гены негативной регуляции, продукты которых способны избирательно отключать целые звенья системы QS или всю систему в целом.

Рис. 1. Общая схема функционирования системы quorum sensing.

Данные принципы являются общими практически для всех типов систем QS не зависимо от их конкретной структурной организации. Запуск системы QS обычно совпадает по времени с ранней стадией экспоненциального роста, для которой является характерным быстрый рост плотности популяции клеток. Экспрессия генов-мишеней же напротив обычно начинается с выходом популяции клеток в стационарную фазу, и обычно является комплексной, то есть, предполагает начало биосинтеза практически всех регулируемых с помощью QS продуктов в короткий промежуток времени. Таким образом, ранние этапы работы системы QS заключаются в. обеспечении биосинтеза сигнальных молекул и рецепторов к ним, до определённого момента, совпадающего с накоплением максимальной концентрации сигнальных молекул в межклеточном пространстве, по достижению которой работа системы QS переходит в самоподдерживающееся состояние.

Механизмы, лежащие в основе ранней активации системы QS, на сегодня окончательно не выяснены. Не смотря на то, что обнаружено большое количество различных регуляторов, которым приписывается определённая роль в ранней активации системы , многие вопросы остаются не решёнными. Прежде всего, не ясно, каким образом регулируется первичное накопление сигнальных молекул и рецепторов к ним. Существует гипотеза о том, что определённое количество сигнальных молекул и рецепторов к ним присутствует в клетках постоянно, и первичное их накопление происходит по тому же самоподдерживающемуся механизму, при этом на синтез сигнальных молекул и рецепторов расходуется часть внутриклеточного пула этих соединений. Остальная же часть выводится из клеток и по достижении пороговой концентрации реабсорбируется и запускает экспрессию генов-мишеней. Однако, исходя из особенностей функционирования некоторых типов системы QS, подобное видится маловероятным. James P. Pearson, напротив, считает что первичный запуск QS осуществляется с помощью неспецифических регуляторов транскрипции таких как MvaT и Vfr (V irulence f actors r egulator) Pseudomonas aeruginosa , и система переходит в самоподдерживающееся состояние значительно позднее.

2.2. Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов

Классической пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему, отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных бактериальных видов. Эта система стимулирует распространение в микробной популяции признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также для устранения конкуренции. Переносимая пептидной кворум-зависимой системой плазмида pPDl отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCDl - за образование бактериоцина, плазмида pCFlO - за устойчивость E.faecalis к тетрациклину. Каждый гекса- или октапептид индуцирует слипание бактериальных клеток и их конъюгацию с переносом от донора к реципиенту определенной плазмиды. Например, октапептид cPDl стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPDl. Плазмида кодирует рецептор, находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Взаимодействие олигопептида с рецептором вызывает диссоциацию репрессора от ДНК, тем самым запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPDl включает также ген traC, продуктом которого является белок, облегчающий проникновение пептида через клеточную стенку. Олигопептидные сигналы интенсивно синтезируются клетками, не несущими соответствующие плазмиды (реципиентами), в то время как у клеток-доноров синтез таких сигналов подавлен, более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид.

Продуктом плазмиды pPDl является пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.

Другим кворум-зависимым процессом, обнаруженным у E.faecalis , является выработка двух вирулентных факторов: желатиназы (GelE) и сериновой протеазы (SprE).

Примером использования пептидного сигнала для осуществления межклеточных взаимодействий может служить система кворум-сенсинга, осуществляющая контроль над синтезом экзотоксинов в поздней логарифмической фазе роста у Staphylococcus aureus . В этой системе белок AgrD синтезируется в виде предшественника, состоящего из 46 аминокислот, который в процессе экспорта белком AgrB превращается в зрелый пептид AIP (autoinducing peptide), состоящий из 8 аминокислот. AIP распознается двухкомпонентной сенсорной киназой AgrC, которая передает сигнал внутрь клетки в процессе фосфорилирования регулятора ответа - AgrA. AgrA~P активирует транскрипцию целевых генов, стимулирует транскрипцию оперона agrB, D, С, А (положительная ауторегуляторная петля), а также «запрещает» транскрипцию генов, кодирующих другие экзотоксины. На основании различий в AIP и его рецепторе штаммы S.aureus могут быть отнесены к четырём или более группам. Олигопептиды, синтезируемые одной из групп, индуцируют патогенность в этой группе и специфически подавляют системы Agr-вирулентности в других группах.

От плотности популяции зависит появление компетентности в поздней логарифмической фазе роста у Streptococcus pneumoniae . Ген соmС кодирует предшественник, состоящий из 41 аминокислотного остатка. Последний преобразуется в зрелый пептид, состоящий из 17 аминокислотных остатков в процессе взаимодействия с системой экспорта пептидов (АВС-система), которую образуют продукты генов соmАВ. Пептид контактирует со своим рецептором на поверхности клетки - гистидинкиназой, продуктом гена comD. Активированная гистидинкиназа фосфорилирует продукт гена соmЕ. По мере накопления клеток количество пептидных сигналов растёт и достигает в среде критического уровня. Соответственно увеличивается и количество фосфорилированного белка cоmЕ, который, начиная с определенной концентрации, связывается с промотором оперона comCDE, стимулируя его работу (положительная ауторегуляторная петля), активирует промотор оперона соmАВ (система экспорта белка из клетки), активирует оперон сотХ, который включает целую цепочку поздних генов компетентности; отвечающих за связывание и поглощение трансформирующей ДНК и все остальные, поздние стадии трансформации.

В добавление к приведённым примерам реакций кворум-сенсинга у грамположительных бактерий нужно отметить, что в качестве сигнальных молекул помимо олигопептидов грамположительными бактериями также используются вещества другой химической природы. Так, у представителей порядка Actinomycetales наряду с пептидными сигнальными молекулами были обнаружены вещества низкомолекулярной природы, большинство из которых содержит лактонную группировку.

У стрептомицетов в системы кворум-сенсинга вовлечены бутиролактоны и соответствующие им белковые рецепторы, которые совместно регулируют морфологическое развитие и образование антибиотиков у их продуцентов . Наиболее хорошо изученным актиномицетным регулятором является А-фактор, представляющий собой 2-изо-каприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.

Влияние А-фактора на морфологическую дифференцировку и антибиотикообразование подчиняется общей схеме работы стрептомицетных регуляторов, содержащих лактонную группировку. На ранних стадиях роста, когда концентрация А-фактора низка, рецептор А-фактора (АгрА) связывается и репрессирует экспрессию общего гипотетического активатора биосинтеза стрептомицина и спорообразования. При выделении АгрА из клеточного лизата S.griseus IFO 13350 было показано, что этот белок состоит из 276 аминокислот и имеет молекулярную массу 29,1 кДа.

Когда плотность культуры возрастает, концентрация А-фактора достигает критического уровня, при котором он связывает АгрА, вызывая диссоциацию последнего от ДНК и, таким образом включая транскрипцию ключевого гена adpA, кодирующего AdpA (белок, состоящий из 405 аминокислот, содержащий в центральном участке сайт связывания с ДНК, схожий с регуляторами транскрипции из семейства белков AraC/XylS). AdpA, в свою очередь, является позитивным регулятором обнаруженного цитоплазматического активатора кластера генов биосинтеза стрептомицина и активаторов процесса спорообразования. Цитоплазматический активатор, связываясь с ДНК в районе промотора гена специфической регуляции кластера биосинтеза стрептомицина strR, индуцирует транскрипцию данного гена, расположенного вслед за ним гена устойчивости к собственному антибиотику - aphD, гена adsA, кодирующего экстрацитоплазматический а-фактор РНК-полимеразы, необходимой для формирования воздушного мицелия, а также гена sgmA, кодирующего белок-пептидазу, участвующую наряду с другими гидролитическими ферментами в деградации белков субстратного мицелия в результате формирования воздушного мицелия. Регуляторный продукт гена strR обусловливает начало транскрипции структурных генов биосинтеза в составе кластера с StrR-зависимых промоторов. Начало экспрессии с промотора strR гена под влиянием цитоплазматического активатора обеспечивает также наработку продукта гена aphD - аминогликозидфосфотрансферазы, и тем самым создание базового уровня устойчивости штамма к собственному антибиотику.

Показано, что у разных видов стрептомицетов наблюдается гомология между структурными элементами регуляторов. Нуклеотидные последовательности, гомологичные гену агрА у S.griseus , обнаружены также у других стрептомицетов. Например, у S.coelicolor A3 (2) было обнаружено два гена сргА и сргВ, кодирующих АгрА-подобные белки СргА и СргВ, которые на 90,7% сходны между собой и на 35% - с АгрА.

Многие живые организмы принимают коллективные решения демократическим путем при помощи так называемого «чувства кворума». Часто это проявляется в том, что при увеличении скученности совокупность особей превращается в организованный коллектив (сообщество, стаю, толпу). Базовые принципы такого превращения сходны у разных организмов - от бактерий до животных. Об этом свидетельствуют результаты двух новых исследований, одно из которых выполнено на светящихся бактериях, другое - на атлантической сельди. Бактерии начинают дружно светиться по достижении пороговой концентрации выделяемых ими веществ, а у рыб сигналом к формированию многомиллионных организованных стай служит время суток и пороговая плотность популяции.

«Чувство кворума» (Quorum sensing ) - широко распространенный в природе механизм, позволяющий группам организмов выполнять координированные, слаженные действия - подобно тому, как это постоянно делают клетки многоклеточного организма. Однако в многоклеточном организме слаженность поведения клеток обеспечивается специальными системами централизованного управления (например, нервной системой). В группе отдельных самостоятельных организмов таких централизованных систем управления обычно нет, поэтому согласованность действий обеспечивается иными способами, в том числе при помощи «чувства кворума».

Это явление лучше всего изучено на одноклеточных организмах, у которых согласованное групповое поведение, как правило, основано на своеобразном химическом «голосовании». Например, все бактерии в популяции выделяют сигнальное вещество, и когда концентрация этого вещества в окружающей среде достигает некого порогового значения, все клетки дружно меняют свое поведение (например, начинают испытывать «тягу» друг к другу и собираться в большие скопления). На молекулярном уровне изменение поведения микробов обеспечивается резким (иногда скачкообразным) изменением уровня активности определенных генов в ответ на пороговый уровень возбуждения рецепторов, реагирующих на сигнальное вещество. Одним из первых объектов, на которых стали изучать чувство кворума, была светящаяся бактерия Vibrio fischeri , о которой рассказано в заметке Симбиоз кальмаров со светящимися бактериями зависит от единственного гена , «Элементы», 06.02.2009.

Ключевым сигналом, запускающим механизм превращения множества разрозненных индивидуумов в единую сплоченную общность, обычно является скученность. Например, Vibrio fischeri не светится, пока плотность популяции микробов остается низкой. Однако по достижении определенного порога плотности (что происходит, например, в светящемся органе кальмара, где бактериям обеспечены идеальные условия для жизни) все микробы разом начинают светиться, и кальмар получает фонарик для охоты в темноте.

У многоклеточных организмов «чувство кворума» и быстрые согласованные изменения поведения тоже широко распространены, хотя и хуже изучены, чем у одноклеточных. Иногда переход от индивидуальной жизни к согласованному групповому поведению может иметь поистине драматические последствия, как, например, у саранчи (см.: Серотонин за два часа превращает скромную пустынную саранчу в хищных налетчиков , «Элементы», 10.02.2009). Характерно, что у саранчи переход к стадному поведению регулируется плотностью популяции (скученностью), точно так же, как и свечение Vibrio fischeri .

На прошлой неделе опубликованы две интересные статьи, посвященные изучению чувства кворума у двух весьма непохожих друг на друга организмов - светящихся бактерий Vibrio harveyi (близких родственников V. fischeri ) и у атлантической сельди. Обе работы основаны на применении новых методов, причем в обоих случаях речь идет о радикальном изменении масштабов рассмотрения изучаемых объектов. В случае с микробами масштаб был изменен в сторону большей детальности: обычно изучают совокупную реакцию больших популяций микробов (например, суммарную силу свечения), однако в данном случае исследователи регистрировали изменения в поведении отдельных микробов. При изучении очень крупных объектов, таких как многомиллионные стаи сельди, обычно приходится ограничиваться небольшими выборками, по которым трудно судить о стае в целом. Однако на этот раз исследователи воспользовались изобретенным три года назад методом высокочувствительного эхолокационного сканирования больших акваторий (Makris et al., 2006 ), который позволил наблюдать за формированием стай протяженностью в десятки километров в реальном времени.

За поведением сельди наблюдали в районе ее нереста в заливе Мэн осенью 2006 года. Оказалось, что в течение нерестового периода сельдь каждый вечер самоорганизуется в громадные скопления численностью до четверти миллиарда особей, которые согласованно и дружно плывут на мелководье, где сельдь нерестится.

В течение дня рыбы плавают порознь вблизи дна в глубоких местах, где хищников гораздо меньше, чем на мелководье. Незадолго до захода солнца сельдь начинает постепенно скапливаться на глубине от 160 до 190 м. Поначалу плотность рыб растет медленно. Однако в тот момент, когда плотность достигает порогового значения 0,2 рыбы на квадратный метр, поведение рыб радикально меняется. Рыбы вдруг устремляются навстречу друг другу и образуют плотное скопление (до 2–5 рыб на кв. м), которое становится своеобразным «центром кристаллизации» для гигантской стаи. От этого первичного скопления стремительно распространяется «волна» измененного поведения: рыбы видят, что их сородичи уже поспешили на сбор, и сами начинают плыть друг к другу.

В результате скопление рыб разрастается со скоростью, на порядок превышающей ту скорость, с которой может плыть отдельная рыба. Наконец образуется плотная стая длиной до 20–30 км и шириной порядка 3–4 км, вытянувшаяся с запада на восток на глубине 160–190 м вдоль северного склона нерестовой отмели. Затем вся эта громадная масса рыб начинает согласованное движение на юг и вверх, к месту нереста. Теперь движение происходит как раз с той скоростью, с какой обычно плавает сельдь. Передний край движущейся стаи ровный и четкий, задний - неровный и размытый из-за «отстающих», которые продолжают подтягиваться из глубины. Нерестится сельдь ночью на глубине около 50 м, а к рассвету стая рассеивается до следующего вечера.

В чем смысл такого поведения? Во-первых, нерест у сельди - дело коллективное, самки должны дружно выметать икру, а самцы - совместными усилиями оплодотворить ее, поэтому синхронизация поведения этим рыбам очень важна. Во-вторых, большинство хищников предпочитает ловить сельдь на мелководье, поэтому рыбам выгодно прибывать на место нереста большими группами (см.: Общественный образ жизни повышает стабильность системы «хищник–жертва» , «Элементы», 29.10.2007), как можно быстрее делать свое дело и возвращаться на относительно безопасную глубину.

Исследование показало, что у сельди, как и у других организмов, обладающих «чувством кворума», внезапное изменение поведения и превращение неорганизованного множества особей в упорядоченное целое происходит в ответ на достижение пороговой концентрации особей (в данном случае пороговая плотность составляет 0,2 особи на кв. м.). На какие сигналы - зрительные или, скажем, обонятельные - ориентируется сельдь, оценивая плотность популяции, пока неизвестно, и выяснить это очень трудно.

Намного проще разобраться в физиологических механизмах «чувства кворума» у бактерий, у которых нет ни зрения, ни слуха, ни нервной системы и которым поэтому доступен только один способ общения - химический, аналогичный запаховой коммуникации у животных.

Однако молекулярно-генетические системы, обеспечивающие «чувство кворума» у бактерий, могут быть очень сложными, что хорошо видно на примере светящегося микроба Vibrio harveyi. Эти бактерии выделяют в окружающую среду три сигнальных вещества-«автоиндуктора» (autoinducers, AI). Каждому веществу соответствует рецептор, реагирующий на наличие «своего» вещества в среде. Все три рецептора передают полученный сигнал внутрь клетки, активируя регуляторный белок LuxU. Он, в свою очередь, активирует другой белок (LuxO), который активирует работу нескольких генов, кодирующих малые регуляторные РНК. Эти регуляторные РНК блокируют работу гена, кодирующего белок LuxR. Последний является ключевым участником регуляторного каскада: от него зависит активность множества генов, в том числе и тех, благодаря которым бактерия светится.

Разумеется, эта непростая система нужна не только для регуляции свечения. От нее зависит множество других аспектов поведения бактерии, просто свечение легче всего регистрировать и измерять. В этой регуляторной системе уже известны многие детали, но кое-что остается загадочным. Например, непонятно, зачем нужны целых три разных сигнальных вещества и три рецептора для них, если всё в конечном итоге сводится к одному и тому же результату: либо ген LuxR оказывается включен, и тогда микробы светятся, либо он выключен, и тогда бактерии гаснут. И дело принципиально не меняется от того, что LuxR регулирует множество разных генов, а не только «гены свечения». Всё равно работа всех подконтрольных систем зависит только от одной переменной: от степени активности гена LuxR . Казалось бы, бактерии вполне могут обойтись одним сигнальным веществом и одним рецептором, то есть одной переменной «на входе», чтобы регулировать одну-единственную переменную «на выходе». Однако бактерии почему-то считают иначе и общаются между собой при помощи трех разных сигнальных веществ.

Чтобы разобраться в этой непростой проблеме, исследователи сконструировали несколько генно-модифицированных штаммов Vibrio harveyi, у которых система химической коммуникации была существенно упрощена. Во-первых, всем бактериям удалили ген, кодирующий один из трех рецепторов. Теперь микробы могли реагировать только на два из трех сигнальных веществ (AI-1 и AI-2). Во-вторых, были отключены гены, необходимые для производства сигнальных веществ. Это было сделано для того, чтобы исследователи могли держать концентрацию веществ AI-1 и AI-2 под своим полным контролем. В-третьих, они прикрепили к регуляторному участку (промотору) одной из малых регуляторных РНК, участвующих в регуляторном каскаде, ген зеленого флуоресцирующего белка. Это дало им возможность по силе флуоресценции отдельных бактериальных клеток судить о степени активации регуляторного каскада «чувства кворума» с гораздо большей точностью и детальностью, чем это можно было бы сделать по силе естественного свечения бактерий.

Оказалось, что оба сигнальных вещества (AI-1 и AI-2) действуют на систему практически одинаково, причем система может находиться в одном из трех устойчивых состояний:

1) Если концентрация обоих веществ низкая, бактерии активно производят зеленый флуоресцирующий белок. Это значит, что синтез белка LuxR приостановлен, и, следовательно, все гены, которые блокируются белком LuxR, работают активно, а все гены, которые этим белком активируются, отключены (в том числе и гены, отвечающие за естественное свечение).

2) Если концентрация любого из двух веществ - AI-1 или AI-2 - поднимается до порогового значения (которое соответствует примерно одной молекуле вещества на объем, занимаемый одной бактерией), то зеленая флуоресценция заметно слабеет, но не прекращается совсем. Это «промежуточное» состояние довольно стабильно. Уровень флуоресценции остается почти неизменным в широком диапазоне концентраций сигнальных веществ - лишь бы концентрация одного из веществ была больше, а второго - меньше порогового уровня.

3) Наконец, если концентрация обоих сигнальных веществ превышает пороговый уровень, зеленый флуоресцирующий белок практически перестает синтезироваться. Это означает, что регуляторный каскад полностью активирован. Только в этом случае включается естественное свечение.

Иными словами, оказалось, что использование двух сигнальных веществ позволило бактериям создать молекулярный «переключатель», способный принимать не два, а три устойчивых состояния. Каждому из этих трех состояний, по-видимому, соответствуют свои наборы включенных и выключенных генов, то есть своя «манера поведения» микробов.

Авторы предполагают, что на самом деле у этого переключателя может быть даже не три, а четыре устойчивых состояния - ведь существует еще и третье сигнальное вещество, которое в экспериментах не учитывалось.

По мнению авторов, такая замысловатая система химической коммуникации позволяет бактериям регулировать свое поведение в зависимости от фазы развития микробного сообщества (биопленки; см. Biofilm ). Теоретически, концентрации сигнальных веществ - равно как и поведение бактерий - могут закономерным образом меняться в ходе развития колоний Vibrio harveyi , и в настоящее время авторы заняты поиском доказательств этого предположения.

«Чувство кворума» у сельдей и у светящихся бактерий вызывает синхронизацию поведения, заставляя всех индивидуумов вести себя одинаково. Однако известны и случаи «бимодальной» реакции популяции на коллективные сигналы. Это означает, что один и тот же сигнал вызывает у разных особей одну из двух альтернативных реакций, причем выбор того или иного варианта может определяться даже не генотипом особи, а простой случайностью. Тем самым достигается разнообразие фенотипов (поведения), независимое от разнообразия генотипов. Обычно при бимодальной реакции устойчивость каждого из двух альтернативных состояний организма обеспечивается за счет положительных обратных связей. Пример такого поведения рассмотрен в заметке Бактерии-альтруисты помогают своим сородичам-каннибалам себя съесть («Элементы», 27.02.2006).

Существует ли «чувство кворума» у людей? По-видимому, ответ на этот вопрос следует искать в научной литературе по так называемой «психологии толпы» (см., например: А. П. Назаретян. Толпа и закономерности ее поведения ).

Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) - это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном.

На конкретный клеточный сигнал клетки в популяции отвечают специфическим ответом. На сегодняшний день установлено, что клеточно-клеточные взаимосвязи влияют на внутрипопуляционную дифференцировку клеток, на экспрессию генов вирулентности, регулируют ростовые процессы, характер и направление подвижности (таксис), а также бактериальный апоптоз и токсинообразование.

Работу QS можно сравнить с гормональной регуляцией функциональной активности различных органов и тканей в многоклеточном организме.

Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы используют различные сигнальные системы и разные химические передатчики сигналов. Первые синтезируют 7-8-членные пептиды (Enterococcus spp.), циклопептиды (Staphylococcus spp.); вторые: разнообразные ацил-гомосерин лактоны (AHL).

Рассмотрим работу QS на примере синегнойной палочки. У данного микроорганизма функционируют, по меньшей мере, три регуляторные системы. Наиболее изученная из них LasI - LasR система (в качестве химического сигнала выступают AHL с длинной ацильной цепью); RhlI - RhlR система (мессенджер - AHL c короткой ацильной цепью, C4-HSL); и хинолоновая PQS система. Взаимодействие этих трех систем позволяет регулировать экспрессию порядка 6-10% генома. В LasI - LasR системе за биосинтез сигнальных молекул отвечает AHL-синтаза, продукт гена lasI. Его экспрессия находится на базальном уровне, поэтому накопление сигнальных молекул происходит достаточно длительно, и биологический эффект начинает проявляться только в стационарной фазе роста популяции. В клетках AHL взаимодействует с LasR-белком (продукт lasR-гена, экспрессия которого также находится на базальном уровне), образуя при этом гомодимер - регулятор транскрипции. Этот регулятор активирует множество генов, участвующих в формировании вирулентности, и в процессах образования биопленок, он также активирует хромосомный регулон las Box, который отвечает за экспрессию различных факторов патогенности (протеазы, эластаза, и прочее). Комплекс LasR + AHL активирует вторую сигнальную систему. Это происходит после взаимодействия с промотором Rhl-генов. Экспрессия RhlI обусловливает образование протеина для синтеза AHL с короткими ацильными остатками (C4-HSL). Ген rhlR кодирует белок (RhlR), который взаимодействует с сигнальными молекулами C4-HSL. Образующийся протеиновый тандем RhlR + C4-HSL регулирует транскрипцию генов, кодирующих различные структурные соединения матрикса биопленок (альгината, рамнолипида и др.), а также липазы, пиоцианина. Также этот транскрипционный регулятор активирует экспрессию другого регулятора - RpoS (сигма-фактор стационарной фазы роста P.aeruginosa), который инициирует образование стрессовых белков клетки и участвует в адаптационных реакциях. Среди клинических изолятов P.aeruginosa обнаружено, что помимо функционирования AHL-сигнальных систем, параллельно вступает хинолоновая система (генный локус - pqsABCDE), мессенджерами являются гидроксиалкилхинолоны и гидроксигептилхинолоны. Эта система функционирует так же, как и вышеописанные механизмы регуляции, и опосредует увеличение экспрессии факторов вирулентности, в частности, синтез эластазы, лектинов. Взаимодействие трех сигнальных систем затрагивает большое количество генов, в связи с чем происходит глобальная регуляция транскрипции, что приводит к очень гибкой лабильности физиологических процессов клетки, и является следствием огромного адаптационного потенциала бактерий в популяции.

Сигнальные системы работают по принципу аутоиндукции, синтезированные сигнальные молекулы действуют на свою же клетку, и по мере их накопления во внеклеточной среде происходит все большая активация зависимых промоторов, регулонов генома клеток. QS на основе AHL обнаружен у многих грамотрицательных бактерий: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia и др.. AHL-коммуникация осуществляется внутри вида, специфичность и сила биологического ответа зависит от химической структуры самой сигнальной молекулы.

Но среди клинических изолятов грамотрицательных бактерий часто наблюдается и перекрестная коммуникация (cross - talk communication), обеспечивающая взаимодействие популяций разных видов в инфекционном очаге. Перекрестный QS способен как активировать, так и ингибировать работу зависимых целевых генов в бактериальных ассоциациях. Например, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila синтезируют один тип сигнальных молекул. QS C.violaceum и A.hydrophila ингибируется AHL-молекулами с длинными ацильными остатками, которые синтезируются различными грамотрицательными микроорганизмами. Синегнойная палочка образует сигнальные молекулы с длинными и короткими ацильными остатками, и они взаимно не ингибируются, однако, мессенджеры E.coli такой же молекулярной структуры с длинными ацильными остатками способны ингибировать rhl-сигнальную систему P.aeruginosa. В смешанных биопленках P.aeruginosa и Burkholderia cepacia, буркхолдерии реагируют на сигналы синегнойной палочки (которая в свою очередь не чувствительна к сигналам B.cepacia), следовательно, популяция P.aeruginosa регулирует многие физиологические процессы своего ассоцианта. Имеются данные, что некоторые штаммы P.aeruginosa, выделенные от больных исцидозом, не способны сами синтезировать аутоиндукторы rhl-сигнальной системы, следствием чего является снижение вирулентности, и неполноценное формирование биопленок в опытах in vitro. Но, однако, in vivo, эти же штаммы синегнойной палочки формируют полноценные биопленки. Выяснено, что микрофлора, выделенная из слизи от тех же больных, синтезирует rhl-аутоиндукторы, регулируя таким образом вирулентность и формирование биопленок P.aeruginosa и инициируя инфекционный процесс. Сами AHL-молекулы неодинаково влияют на другие группы бактерий, установлено например, что аутоиндукторы синегнойной палочки блокируют работу QS у S.aureus. Сигнальные молекулы прокариот способны влиять и на поведение клеток грибов, растений, и даже животных клеток. Так, AHL P.aeruginosa подавляет процесс филаментации Candida albicans.

В организме человека AHL-молекулы ингибируют пролиферацию лейкоцитов и процесс образования фактора некроза опухолей б. В высоких концентрациях AHL инициируют апоптоз разных типов иммунокомпетентных клеток. В целом, бактериальные аутоиндукторы оказывают иммуносупрессирующее действие. Именно за счет реакций QS осуществляются «социальные» отношения внутри популяции, образуется «химическая коммуникационная сеть» биопленки, которая может охватывать мультиводовое сообщество.

Не менее интересна работа сигнальных систем среди грамположительных микроорганизмов. Например, у Enterococcus spp. QS регулирует процесс переноса плазмид (от донорной к реципиентной клетке) через механизм конъюгации. Клетка-реципиент синтезирует специфический пептидный сигнал («половой» бактериальный феромон) который накапливается в среде и специфически связывается с рецепторами клеток-доноров, несущими плазмиду, которая соответствует этому феромону. Запускаемая при этом регуляторная система обеспечивает экспрессию факторов, опосредующих клеточное взаимодействие и перенос плазмиды (компоненты конъюгации). Как отмечалось выше, определенной плазмиде соответствует конкретный феромон. За счет такого строгого механизма взаимодействия осуществляется бактериальная селекция клеток внутри биопленки. Посредством такой коммуникации траслоцируются плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов. Обычно биологически активные сигнальные пептиды закодированы в хромосоме, а рецепторные белки, обеспечивающие аффинитет к феромонам закодированы в самих плазмидах. После транслокации плазмиды в клетку реципиента, она начинает синтез ингибиторов феромонов, для каждого типа феромона соответствует свой ингибитор. Это свойство позволяет выключать сигнал для уже имеющейся плазмиды, и усиливать накопление молекул феромонов для другого типа плазмид. биоплёнка микроорганизм клетка

За счет работы подобной системы в популяции биопленки постоянно происходит положительная селекция штаммов с выгодными свойствами и отрицательная селекция - элиминация штаммов, с «ненужными» фенотипами. При инфекционных поражениях такие коммуникативные механизмы передачи мобильных генетических элементов позволяют с максимальной скоростью распространять гены антибиотикорезистентности, вирулентности, дополнительные физиологические возможности.

Наибольший интерес представляет QS, участвующий в регуляции экспрессии факторов вирулентности у стафилококков. Генетической основой работы этой системы является agrABCD - хромосомный локус. В качестве передатчиков сигналов выступают циклопептиды - аутоиндукторы (AIP, auto-inducing peptide), которые классифицированы по строению и биологическому эффекту на группы и субгруппы, например, 1 и 4 субгруппы у S.aureus увеличивают экспрессию факторов вирулентности. Эти молекулы крайне специфичны, замена хоты бы одной аминокислоты в структуре соединения, ведет к потере биологической функции. Как и с примерами сигнальной - ингибиторной системы у энтерококков, стафилококковая система реагирует только на один тип аутоиндукторов, как только клетка получила специфический сигнал, активируются гены-ингибиторы, и клетка уже не способна воспринимать другие сигналы. Такой механизм обеспечивает жесткую популяционную селекцию. Синтезированные сигнальные молекулы взаимодействуют с гистидинкиназной мембранной системой (agrC), которая через каскад реакций активирует регулятор транскрипции (agrA). Этот белок осуществляет бифункциональную регуляцию двух промоторов P2 и P3. Соответственно, транскриптами этих зависимых генов является РНК II и РНК III, первая содержит основные agr-гены, таким образом проявляется аутоиндуктивный ответ системы. В свою очередь РНК III обеспечивает регуляцию синтеза факторов вирулентности (ДНКазы, фибринолизина, энтеротоксина, б-, в-, д-токсинов и др.). Интересной особенностью на данном этапе регуляции является то, что транскрипт РНК III размером в 500 пар нуклеотидов не несет кодируемой информации, за исключением одной открытой рамки считывания для д-токсина. Подавляющая часть молекулы транскрипта сама выступает как рибосомальный ингибитор. РНК III блокирует процесс трансляции фактора репрессии вирулентности Rot (repressor of toxins), регулирующий синтез стафилококковых токсинов, следствием чего является неконтролируемое образование экзотоксинов. Таким образом, agr-система обеспечивает популяционную регуляцию экспрессии факторов вирулентности стафилококков. Используя различные варианты ПЦР-исследований, установлено, что экспрессия agr-локуса в клетках наблюдается при многих стафилококковых поражениях: инфекции кожи, эндокардиты, артриты, сепсис. В популяции биопленок накапливаются сигнальные молекулы, синтезируемые подавляющим большинством клеток, являющихся метаболическим и генетическим «ядром, кворумом» популяции, они задают метаболическое поведение, фенотипические изменения для всех клеток. Это осуществляется за счет аккумуляции сигналов через свойство аутоиндукции, и ингибирование других сигналов, синтезируемыми меньшинством, либо вообще иными штаммами в биопленке за счет параллельного механизма ингибирования. 1.5.Клиническое значение биоплёнок.

Представления о биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили взгляды на инфекционные заболевания. Все новые данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, а фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток.

Существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их диагностике и лечению. Кроме того, традиционные бактериологические методы не выявляют большинство бактерий, участвующих в инфекционном процессе. Новейшие молекулярные, геномные, транскрипционные и протеомные методы позволили определить, что при выделении чистой культуры определяется лишь около 1% клеток патогенного микробиоценоза. В результате лечение нацелено лишь на 1-2 вида бактерий из множества штаммов, присутствующих в составе биопленки (в том числе, возможно, и грибов).

К настоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как инфекции, связанные с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и другими грамположительными микроорганизмами; инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками; пародонтит, обусловленный рядом микроорганизмов полости рта; инфекции мочевых путей, определяемые Е. coli и др. патогенами; инфекции среднего уха -- причина, например, Haemophilus influenzae, муковисцидоз, вызываемый P. Aeruginosa и др.

Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов. Далеко не до конца ясны механизмы, по которым микроорганизмы, образующие биопленки, вызывают патологические процессы в макроорганизме.

Кроме тканей организма хозяина, микробные биопленки колонизируют различные медицинские устройства небиологической природы, внедряемые в организм человека (катетеры, водители ритма, сердечные клапаны, ортопедические устройства). Исследования имплантированных медицинских устройств с применением электронной микроскопии показали присутствие бактериальных биопленок.

Возрастающая антибиотикорезистентность и развитие бактериальных биопленок являются основными проблемами в лечении инфекций мочевых путей.

Установлено, что в основе повышенной устойчивости лежат свойства клеток и внеклеточного матрикса. Матрикс биопленки может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики. Устойчивость, обусловленную свойствами клеток биопленки, объясняют уменьшением их свободной поверхности за счет контактов друг с другом и формированием особых бактерий, получивших название персистеров.

Персистеры это альтруистические клетки, которые образуются в стационарной фазе роста, они метаболически не активны и обеспечивают выживание материнской популяции в присутствии летальных, для всех клеток, факторов. В биопленках эта субпопуляция составляет 1-5% от всей клеточной массы. Формирование таких клеток зависит от степени роста популяции, в лог-фазе культура не образует или образует очень небольшую долю персистеров, их количество увеличивается к стационарной фазе. Образование субпопуляции обратно зависимо от уровня метаболической активности всех клеток биопленки, а также от действия экзогенных неблагоприятных факторов. Фенотип персистеров характеризуется интересной биологией, они замедляют все физиологические процессы и становятся толерантными к действию разных факторов, в том числе и к воздействию антимикробных препаратов.

Свойство антибиотикотолерантности отличается от механизмов резистентности. Действиевсех механизмов устойчивости бактерий, по существу, можно свести к одному явлению - это предотвращение взаимодействия антибиотика с его мишенью (за счет изменений самих мишеней, или с помощью синтеза ферментов, нейтрализующих антибиотики). Толерантность же опосредуется способностью микробной клетки выживать в присутствии антибиотика за счет замедления метаболизма и «выключения» основных биологических процессов клетки.

Основными же механизмами повышения устойчивости бактерий к антибиотикам в биопленках являются:

1. ограничение проникновения антибиотиков через биопленки;

2. ограничение питания и измененная микросреда в биопленке приводят к уменьшению скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков;

3. адаптивные реакции;

4. генная изменчивость у персистирующих в биопленке бактерий.

Исходя из накопившихся данных, следует, что антибиотики по действию набактерии биопленок разделяются на два типа. К первому относят антибиотики, проникающие в биопленки и угнетающие или убивающие образующие их микроорганизмы. Второй тип -- антибиотики, практически не проникающие в биопленки, но эффективно препятствующие их расселению за счет мигрирующих бактерий. Таким образом, некоторые антибиотики не проникают в биопленки и не уничтожают существующие сообщества, а только препятствуют увеличению их числа и распространению в организме человека. В связи с этим в последние годы началось изучение способности антибиотиков проникать в биопленки различных микробов.

Установлено, что в биопленки Klebsiella pneumoniae плохо проникает ампициллин, а в сообщества Enterococcus faecalis -- ампициллин, ко-тримаксозол и ванкомицин. В биопленки ряда микробов плохо проникает широко используемый амоксициллин.

К числу антибиотиков, хорошо проникающих через липиды клеток, относятся фторхинолоны. Эта группа антимикробных препаратов способна действовать на основные возбудители урологических заболеваний, в достаточной концентрации проникает в очаг инфекции. Имеющийся опыт использования антибиотиков свидетельствует, что с инфекционным процессом, прежде всего с его клиническими проявлениями, можно справиться с помощью антибиотиков, как проникающих, так и не проникающих в биопленки. Однако разница между ними существует, и она достаточно существенна. Показано, что различия антибиотиков, проникающих и непроникающих в биопленки, могут проявляться в отдаленных результатах лечения. Использование антибиотиков, плохо проникающих в биопленку, очень быстро приводит к формированию и отбору устойчивых штаммов. Кроме того, при этом чаще возникают рецидивы и формируются очаги хронических процессов.

Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия.

) общаться и координировать своё поведение за счёт секреции молекулярных сигналов.

Назначение чувства кворума

Назначение чувство кворума - координировать определённое поведение или действия между бактериями того же вида или подвида в зависимости от плотности их населения. Например, оппортунистические патогенные бактерии Pseudomonas aeruginosa могут размножаться в пределах хозяина без ущерба, пока они не достигают определённой концентрации. Но они становятся агрессивными, когда их число становится достаточным, чтобы преодолеть иммунную систему хозяина, приводя к развитию болезни. Для того чтобы сделать это, бактериям необходимо сформировать биоплёнки на поверхности тела хозяина. Возможно, что терапевтическая ферментативная деградация сигнальных молекул предотвращает образование таких биоплёнок. Разрушение сигнального процесса таким образом - подавление чувства кворума.

Роль чувства кворума у некоторых организмов

Чувство кворума впервые наблюдалось у бактерии Vibrio fischeri , биолюминецсентной бактерии, живущей как симбионт в световых органах одного из видов гавайских кальмаров. Когда клетки Vibrio fischeri живут свободно, автоиндукторы находятся в низкой концентрации, и поэтому клетки не люминесцирующие. В световом органе кальмара (фотофоры) они чрезвычайно сконцентрированы (около 10 11 клеток/мл), и поэтому индуцируется транскрипция люциферазы, приводя к биолюминесценции.

Процессы, которые регулируются или частично регулируются чувством кворума на основе AI-2 у кишечной палочки , включают деление клетки. У других видов, например - Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), связанные с чувством кворума процессы включают развитие биоплёнок, производство экзополисахаридов и агрегацию клеток. Обнаружено, что AI-2 увеличивает экспрессию гена sdiA, регулятора транскрипции промотора, регулирующего ген ftsQ, часть оперона ftsQAZ, важного для деления клетки.

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) использует чувство кворума, чтобы сделать клетки компетентными. Это может быть важным для увеличения количества мутаций в условиях перенаселения, когда возникает необходимость колонизации новых окружений.

Напишите отзыв о статье "Чувство кворума"

Отрывок, характеризующий Чувство кворума