Другие заболевания

Схема использования биохимического метода. Биохимические методы анализа. Оптические методы исследования

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, методы количественного определения неорганических и органических веществ, основанные на использовании процессов с участием биологических компонентов (ферментов, антител и др.). Аналитический сигнал - конечную концентрацию одного из продуктов реакции либо начальную скорость процесса, положенного в основу методики определения, регистрируют главным образом спектрофотометрическими, люминесцентными, электрохимическими методами. Наиболее распространены ферментативные и иммунохимические биохимические методы анализа.

В ферментативных методах используют зависимость скорости химической реакции, катализируемой ферментом, от концентраций реагирующих веществ и фермента. Достоинства ферментативных биохимических методов анализа: высокая чувствительность, селективность, экспрессность и мягкие условия (25-37 °С, pH 5-10) проведения анализа. Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетических характеристик используемой индикаторной ферментативной реакции и, главным образом, каталитической активности фермента, от способа детектирования аналитического сигнала. Высокая селективность ферментативных биохимических методов анализа обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса, требующим структурного соответствия субстрата активному центру фермента. С помощью ферментативных биохимических методов анализа определяют ферменты, субстраты, кофакторы и коферменты, активаторы и ингибиторы ферментов. Известны многочисленные высокочувствительные (нижние границы определяемых содержаний 10 -9 -10 -6 моль/дм 3) и селективные ферментативные биохимические методы анализа определения ионов металлов, неорганических анионов, пестицидов, фенолов, аминокислот, метаболитов, мутагенов, канцерогенов и других биологически активных соединений. Для создания биосенсоров, ферментных реакторов, разработки простых и экспрессных тест-методов определения токсикантов используют иммобилизованные ферменты. Высокая стабильность, возможность многократного использования иммобилизованных ферментов повышают экономичность, экспрессность анализа, позволяют его автоматизировать. Ферментативные биохимические методы анализа применяют в анализе объектов медицины (биологических жидкостей, тканей живых организмов), окружающей среды (природных и сточных вод, почв, воздуха, тканей растений), пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов.

Иммунохимические методы основаны на специфическом связывании определяемого соединения - антигена - соответствующими антителами. Малые концентрации комплекса антиген - антитело определяют, вводя в один из компонентов системы метку, детектируемую соответствующим инструментальным методом. Детектируемый сигнал пропорционален концентрации антигена. Используют изотопные, флуоресцентные, парамагнитные, ферментные метки. Анализ с использованием ферментной метки - иммуноферментный анализ - сочетает высокую чувствительность определения метки (предел обнаружения менее 10 -12 моль/дм 3) с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Иммунохимические биохимические методы анализа применяют для определения белков, пестицидов, гормонов, стероидов, наркотических и лекарственных средств, вирусов и клеток. Достоинства иммунохимического биохимического метода анализа: высокая чувствительность и специфичность определения, возможность использования малых объёмов анализируемой пробы (5-50 мкл). Время анализа - несколько минут. Разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы для экспресс-определения биологически активных соединений в медицине, ветеринарии, микробиологической, фармакологической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, в объектах окружающей среды.

Лит.: Долманова И. Ф., Угарова Н. Н. Ферментативные методы анализа // Журнал аналитической химии. 1980. Т. 35. Вып. 8; Кулис Ю. Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс, 1981: Теория и практика иммуноферментного анализа. М., 1991.

Биохимический метод - основной метод в биохимии из основных методов диагностики различных заболеваний, которые вызывают нарушение обмена веществ. Именно об этом методе анализа и пойдет речь в данной статье.

Объекты диагностики

Объектами диагностики биохимического анализа являются:

кровь;
моча;
пот и другие биологические жидкости;
ткани;
клетки.

Биохимический метод исследования позволяет определять активность ферментов, содержание продуктов метаболизма в различных биологических жидкостях, а также выявлять нарушения в обмене веществ, которые обусловлены наследственным фактором.

История

Открыт биохимический метод английским врачом А. Гарродом в начале ХХ века. Он изучал алкаптонурию, и в ходе изучения им было установлено, что врожденный метаболизм или заболевание обмена веществ можно определить по признаку отсутствия специфических ферментов.

Различные наследственные заболевания обуславливаются мутациями в генах, которые изменяют структуру и скорость синтеза белков в организме. При этом нарушается углеводный, белковый и липидный обмен.

Основное

В целях клинической диагностики изучается химсостав биологических материалов и тканей, так как при патологии могут проявиться изменения концентрации, отсутствие компонентов или наоборот появление какого-либо другого компонента. По определяют количество определенных веществ, гормональный баланс, ферменты.

Исследуются молекулы, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества, которые входят в состав живого организма.

Результаты

Результат биохимического метода исследования может быть разделен на качественный (обнаружен или не обнаружен) и количественный (каково содержание того или иного вещества в биоматериале).

В качественном методе исследования используются свойства, характерные для используемого вещества, которые проявляются при определенных химических воздействиях (при нагревании, при прибавлении реагентов).

Прямой определяется на основе этого же принципа, но сначала определяют обнаружение какого-либо вещества, а затем уже измеряют его концентрацию.

Гормоны, медиаторы содержатся в организме в очень малых количествах, поэтому их содержание измеряют при помощи биологических тест-объектов (например, отдельного органа или целого экспериментального животного). Этим повышается чувствительность и специфичность исследований.

Историческая эволюция

Биохимический метод совершенствуется, чтобы получать наиболее точный результат и информацию о состоянии обменных процессов в организме, процессов обмена веществ в определенных органах и клетках. В последнее время биологические методы диагностики сочетают с другими методами исследований, такими как иммунные, гистологические, цитологические и другие. Для использования более сложного метода или методов обычно используют специальное оборудование.

Существует другое направление биохимического метода, которое не вызывается запросом клинической диагностики. С помощью разработки и применения быстрого и максимально упрощенного метода, который может позволить за несколько минут определить оценку нужных биохимических показателей.

В наше время лаборатории оснащены новейшим усовершенствованным оборудованием и механическими и автоматическими системами и приборами (анализаторами), которые позволяют быстро и точно определить нужный показатель.

Биохимический метод изучения: способы

Измерение какого-либо вещества в биологических жидкостях и их определение осуществляется разными многочисленными способами. Например, определить такой показатель как холестеринэстераза, можно сотнями вариантов методов биохимического исследования. Выбор конкретной методики во многом зависит от характера исследуемых биологических жидкостей.

Биохимический метод исследования используется для определения одного вещества или показателя как однократно, так и в динамике. Этот показатель проверяют при определенном времени суток, под определенной нагрузкой, в процессе заболевания, при приеме каких-либо препаратов.

Особенности метода

Особенности биохимического метода:

минимальное количество используемого биоматериала;
скорость выполнения анализа;
возможное многократное применение данного метода;
точность;
биохимический метод можно использовать в процессе болезни;
прием препаратов не влияет на результат исследования.

Биохимические методы генетики

В генетике чаще всего используется цитогенетический метод исследования. Он позволяет подробно изучить хромосомные структуры и их кариотип. С помощью данного метода можно выявить наследственные и моногенные заболевания, которые связаны с мутациями и полиморфизмами генов и их структур.

Биохимический метод генетики сейчас широко используется для того, чтобы находить новые формы мутантных аллелей в ДНК. При помощи данного метода было выявлено и описано больше 1000 вариантов заболеваний обмена веществ. Большинство описанных заболеваний - это болезни, которые связаны с дефектами ферментов и других структурных белков.

Диагностика нарушений обменных процессов биохимическими методами проводится двумя этапами.

Первый этап:

проводится отбор предположительных случаев заболевания.

Второй этап:

уточняется диагноз заболевания более точной и сложной методикой.

Новорожденным детям в пренатальный период при помощи биохимического метода исследования проводится диагностика наследственных заболеваний, что позволяет своевременно обнаружить патологию и вовремя начинать лечение.

Виды метода

Биохимический метод генетики может иметь множество видов. Все они делятся на две группы:

Биохимические методы, в основе которых лежит выявление определенных биохимических продуктов. Это обусловлено изменениями действий различных аллелей.
Метод, который основывается на том, чтобы непосредственно выявить измененные нуклеиновые кислоты и белки при помощи гель-электрофореза в сочетании с другими методиками, такими как блот-гибридизация, авторадиография.

Биохимический метод помогает выявить гетерозиготные носители различных заболеваний. в человеческом организме ведут к появлению аллелей и к хромосомным перестройкам, которые плохо влияют на здоровье человека.

Также биохимические методы диагностики позволяют выявить различные полиморфизмы и мутации генов. Усовершенствование биохимического метода и биохимической диагностики в наше время помогает выявить и подтвердить большое количество различных нарушений обменных процессов организма.

В статье был рассмотрен биохимический метод анализа.

Современные методы изучения генетики человека .

В лабораторной диагностике наследственных болезней наряду с классическими методами широко используются современные, новые методы: цитогенетический, имунногенетический, биохимический, онтогенетический, молекулярно-генетические методы и т.д.

Биохимический метод.

Биохимический метод является основным в диагностике многих моногенных болезней, приводящих к нарушению обмена веществ. Объектами биохимической диагностики являются биологические жидкости: кровь, моча, пот, амниотическая жидкость и т.д. С помощью данного метода можно определить в биологических жидкостях активность ферментов или содержание некоторых продуктов метаболизма.

Практически во всех случаях биохимическая диагностика включает 2 уровня: первичный и уточняющий. Целью первичного уровня диагностики является исключение здоровых индивидов из дальнейшего обследования, для этого используют 2 вида программ диагностики: массовые и селективные. Массовые просеивающие программы применяют для диагностики у новорожденных таких заболеваний как фенилкетонурия, врожденный гипотериоз, муковисцедоз, галактоземия. Например, для диагностики фенилкетонурии кровь новорожденных берут на 3-5 день после рождения. Капли крови помещают на хроматографическую или фильтровальную бумагу и пересылают в лабораторию для определения фенилаланина. Для определения врожденного гипотереоза в крови ребенка на 3 день жизни определяют уровень тироксина. Просеивающая программа массовой диагностики наследственных болезней применяются не только среди новорожденных. Они могут быть организованны для выявления тех болезней которые распространены в каких либо группах населения. Например с США организована просеивающая биохимическая программа по выявлению гетерозиготнвх носителей идиотии Тей-Сакса (она чаще встречается среди евреев-ашкенази). На Кипре и в Италии организовано биохимическое исследование гетерозиготных несителей талассемии.

Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни.

В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии или тест с динитрофенилгидрозином для выявления кетокислот в моче) или более точные методы. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот и мукополисахаридов. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.

На сегодняшний день в нашей стране внедрена программа обязательного селективного скрининга на определение наследственных болезней обмена веществ. с проведением 14ти тестов анализов мочи и крови: на белок, кетокислоты, цистин и т.д. На втором этапе, применяя методы тонкослойной хроматографии мочи и крови, можно выявить более 140 наследственных болезней обмена веществ, такие как болезни углеводного обмена, лизосомальные болезни накопления, болезни обмена металлов, аминоацидопатии и т.д.

Широкое применение нашел биохимический метод в пренатальной диагностике врожденных пороков развития. Биохимические методы включают определение уровня альфа- фетопротеина, хорионического ганадотропина в сыворотке крови беременной. Эти методы являются просеивающими для выявления врожденных пороков развития. Например, при дефектах невральной трубки повышается уровень альфа-фетопротеина.

Цитогенетический метод.

Цитогенетический метод, основанный на изучении количества и структуры хромосом в норме и при патологии.

Основными показаниями для цитогенетического исследования являются:

1) пренатальная диагностика пола плода в семьях, отягощенных заболеваниями, сцепленными с Х-хромосомой;

2) недифференцированная олигофрения (слабоумие);

3) привычные выкидыши и мертворождения;

4) множественные врожденные пороки развития у ребенка;

5) бесплодие у мужчин;

6) нарушение менструального цикла (первичная аменорея);

7) пренатальная диагностика при возрасте матери старше 35 лет.

Этот метод стал широко применяться в медицинской практике с 1956 года, когда Тио и Леван определили, что у человека 46 хромосом. Первая классификация хромосом человека, предложенная в Денвере заложила основу для последующих номенклатур хромосом.

Наиболее современной считается Международная система цитогенетической номенклатуры хромосом человека сокращенно ISCN, принятая в Вашингтоне в 1995 году.

Согласно последней номенклатуре в хромосоме длинное плечо обозначают q , а короткое p. В каждом районе хромосомы полосы и сегменты пронумерованы последовательно от центромеры к теломере. Использование метода дифференциального окрашивания хромосом позволяет выделять индивидуальный рисунок каждой хромосомы вследствие того, что в хромосоме участки эу- и гетерохроматина по-разному окрашиваются красителями.

Объектами для цитогенетического исследования служат метафазные хромосомы, которые можно изучать с помощью прямых и непрямых методов.

Прямые – это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования, их используют для изучения клеток костного мозга и клеток опухолей. Непрямые методы – это методы получения препаратов хромосом из культивированных в искусственных питательных средах, например, при культивировании лимфоцитов периферической крови человека.

С помощью непрямых методов возможно проводить: кариотипирование – определение количества и качества хромосом; генетический пол организма; диагностику геномных мутаций и хромосомных аберраций. Например, синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), синдром Патау (трисомия по 13-й хромосоме), синдром Эдвардса (трисомия по 18-й хромосоме), синдром «кошачьего крика» (делеция 5-й хромосомы), синдром Вольфа-Хиршхорна (частичная моносомия 4-й хромосомы).

Для изучения половых хромосом, в частности Y-хромосомы, используют специальную окраску акрихиниприт (флюоресцирующая) и исследование проводят в ультрафиолетовом свете. Y-хроматин – это сильно светящаяся точка, обнаруживается в ядрах клеток мужского организма, и число Y-телец соответствует числу Y-хромосом в кариотипе. Окончательный диагноз хромосомной болезни выставляется только после исследования кариотипа.

Чтобы быстро определить изменения числа половых хромосом применяют экспресс-метод определения полового хроматина. Половой хроматин или тельце Барра представляет собой одну из двух X-хромосом, причем в инактивированном виде. Оно выявляется в виде сгустка треугольной или овальной формы около внутренней мембраны ядерной оболочки. В норме половой хроматин обнаруживается только у женщин. При увеличении числа Х-хромосом увеличивается и количество телец Барра. При уменьшении числа Х-хромосом (синдром Шерешевского-Тернера, кариотип 45 ХО) тельце Барра отсутствует. В норме у мужчин половой хроматин не обнаруживается, его наличие может свидетельствовать о синдроме Клайнфельтера (кариотип 47 ХХY).

Цитогенетический метод применяют для пренатальной диагностики наследственных заболеваний. Для этого проводят амниоцентез, получают амниотическую жидкость с клетками кожи плода, затем клеточный материал исследуют для дородовой диагностики хромосомных аберраций и геномных мутаций, а также пола плода. Обнаружение изменение количества и структуры хромосом дает возможность своевременного прерывания беременности с целью предупреждения потомства с грубейшими аномалиями развития.

Иммуногенетический метод.

Этот метод применяется у пациентов при подозрении на имунодефицитные заболевания (например, агаммаглобулинемии – почти полное отсутствие глобулинов в крови), при несовместимости антигенов матери и плода, для определения наследственной предрасположенности к заболеваниям при установлении отцовства.

Для диагностики имуунодефицитных состояний исследуют глобулины, Т и В-лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги. Определяются антигены эритроцитов, лейкоцитов и сыворотки крови.

Для пренатальной диагностики можно определять HLA-антигены в лейкоцитах человека. По этим антигенам можно установить адреногенетальный синдром (или врожденная дисфункция коры надпочечников, при которой повышается синтез андрогенов в коре надпочечников). У девочек это проявляется ложным гермафродитизмом, а у мальчиков преждевременным половым созреванием.

Иммуногенетические методы достаточно дорогостоящие, но очень эффективные для определения предрасположенности к наследственным заболеваниям или для прогнозирования здоровья будущих детей.

Онтогенетический метод.

В генетике человека широко распространен онтогенетический метод. Он основан на изучении закономерности проявления какого-либо признака или заболевания в процессе индивидуального развития.

Выделяют несколько периодов развития человека: пренатальный и постнатальный. Большинство признаков формируется во время пренатального периода. После рождения заканчивается формирование коры головного мозга, постепенно формируется психика ребенка, его способность к обучению, происходит становление иммунной системы. В различные периоды развития человека происходит изменение активности генов, при чем может наблюдаться как «включение» и «выключение» генов, так и «усиление» и «ослабление» генов.

В постнатальный период, например, происходит включение генов определяющих развитие вторичных половых признаков, развитие наследственных заболеваний (сахарного диабета, близорукости, миопатии Дюшена и т.д.). В этот же период происходит выключение многих генов. Репрессируются активности генов, связанных с выработкой меланина (в результате происходит поседение волос). Не происходит синтеза эластазы (вследствие чего появляются морщины), подавляется выработка гаммаглобулинов (поэтому повышается восприимчивость к бактериальным инфекциям).

С возрастом может меняться проявление доминирования генов, находящихся в гетерозиготном состоянии, что вызывает изменение внешних признаков, особенно в период полового созревания и беременности.

В старости у человека меняется соотношение женских и мужских половых гормонов. В результате у мужчин меняется тембр голоса, форма тела, происходит отложение жира по женскому типу, меняется психика – мужчины становятся плаксивыми и впечатлительными. У женщин грубеет голос, меняется фигура.

С возрастом рецессивные гены могут оказывать большее влияние на развитие того или иного признака. У гетерозиготного по генотипу человека, например, по фенилкетонурии изменяется психика.

Наряду с «временем действия генов» выделяют и «поле действия генов». В каждой клетке человека, за исключение зрелых половых клеток содержится одинаковый диплоидный набор хромосом и одинаковый набор генов, но в процессе онтогенеза и формирования органов и тканей, одни из генов блокируются, а другие включаются в работу. Так, например, только в клетках щитовидной железы работают гены, отвечающие за синтез гормона тироксина, а в клетках поджелудочной железы – гормона инсулина. В клетках других органов тоже есть такие гены, но они блокированы.

У человека в процессе онтогенеза формируется конституция. Конституционные признаки имеют сложную генетическую основу или могут возникать в результате ранней физической нагрузки. Конституционными признаками называют такие признаки структуры, функции или поведения, которые характерны для процессов роста, созревания и старения.

Медицина стала все больше обращать внимание на конституционные болезни. Оказалось, что люди астенического телосложения более склонны к развитию туберкулеза легких, и, наоборот, у полных людей чаще наблюдается атеросклероз и гипертоническая болезнь.

Молекулярно-генетические методы.

Успехи, достигнутые в последние годы в молекулярной биологии, биохимии, медицинской генетике привели к созданию и внедрению в практическую медицину молекулярно-генетических методов. С помощью этих методов исследуется геном человека и осуществляется диагностика целого ряда наследственных и широко распространенных заболеваний. Методы ДНК-диагностики позволяют осуществлять точную и, что очень важно, доклиническую (до развития симптомов заболевания) диагностику многих заболеваний, проводить пренатальную (дородовую) диагностику наследственных болезней. Молекулярно-генетическая диагностика может быть проведена на самых ранних этапах развития эмбриона и плода независимо от биохимических или клинических проявлений болезни. Это подчас является решающим для решения вопроса о судьбе конкретной беременности.

Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления особенностей в структуре ДНК.

У каждого человека во всех соматических клетках структура ДНК совершенно одинакова.

ДНК может быть выделена из любого типа тканей или клеток организма, содержащей ядра. Чаще всего для получения образцов ДНК используют лейкоциты периферической крови и клетки ворсин хориона.

В 70-е годы 20 века вследствие интенсивного развития молекулярной биологии и создании совершенной методической базы генетических исследований возникло направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК – генное зондирование (гибридизационный анализ). Регистрация последовательностей небольшой длины до 30 пар нуклеотидов осуществляется с помощью синтезированных с радиоактивным мечением участков ДНК, названных зондами. Такие зонды гибридизировались с изучаемыми образцами ДНК. В этом подходе использовались универсальные свойства нуклеиновых кислот образовывать двойные нити, соединяясь между собой за счет комплиментарных нуклеотидов и образуя классические пары: аденин-тимин (АТ) и гуанин-цитозин (ГЦ). Если известна первичная структура нормального и мутантного аллелей искомого гена, то для обнаружения повреждения вводят зонд, который специфически соединяется либо с нормальным, либо с мутантным геном. Патология выявляется путем обнаружения радиоактивных импульсов на рентгеновской пленке. Этот метод широко применяется в практике диагностики наследственных болезней. В настоящее время с его помощью проводится диагностика талассемий, фенилкетонурии, недостаточности альфа-антитрипсина.

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и копировать с помощью термостабильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. В основе метода лежит многоцикловый процесс, напоминающий естественную репликацию ДНК, при чем каждый цикл состоит из 3-х этапов.

На первом этапе при высокой температуре 70-80 0 С ДНК денатурируется на две отдельные цепи.

На втором этапе к определенному участку каждой цепи ДНК присоединяются праймеры. Праймеры – это последовательности нуклеотидов, специфичные для каждого гена. Они комплементарны известным нуклеотидам. Этот этап протекает при t 37 0 С.

На третьем этапе происходит синтез новых цепей ДНК при участии фермента ДНК-полимеразы, опять при высокой t. Эти этапы повторяются до получения стабильного продукта ПЦР.

Дальнейший продукт ПЦР подвергается электрофорезу и анализу.

ПЦР эффективно используют в дородовой диагностике. Достаточно небольшого количества клеток ворсин хориона или других клеток плода, чтобы исследовать их и дать через два дня заключение о наличии или отсутствии у будущего ребенка мутантного аллеля.

Сегодня молекулярно-генетические методы используются для диагностики более 300 наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатий, митохондриальных болезней, муковисцедозе и т.д.

Кроме того ДНК-технологии находят свое применение для расшифровки генома человека, в судебной медицине, для определения отцовства и степени родства, для анализа клеток красного мозга донора и реципиента при трансплантации органов.

Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях) лучше отражают сущность болезни, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Значимость биохимических методов повышалась по мере их совершенствования (электрофорез, хроматография, спектроскопия и др.) и описания наследственных болезней. В 80-х годах ХХ в. был выделен целый раздел - наследственные болезни обмена веществ, т.е. заболевания с различными биохимическими нарушениями.

Биохимические методы направлены на определение биохимического фенотипа организма. Уровни, на которых оценивают фенотип, могут быть разными - от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в крови, моче или поте. Биохимические методы чрезвычайно многообразны, и их значение в диагностике наследственных болезней постоянно возрастает. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики частично снизила интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаев указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярногенетически описывают генотип, а биохимически - фенотип.
Болезнь в конечном счете - фенотип. В связи с этим, несмотря на сложность, а иногда и дороговизну биохимических методов, им принадлежит существенная роль в диагностике моногенных наследственных заболеваний. Современные высокоточные технологии (высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия, газовая хроматография, тандемная спектрометрия) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфичные для конкретной наследственной болезни.

На первый взгляд может показаться, что самый точный метод диагностики - определение мутации на уровне ДНК. Тем не менее это не всегда так. Реализация действия гена - сложный процесс, поэтому нормальная структура гена, а точнее - отсутствие мутации, не всегда служит полной гарантией нормального биохимического фенотипа.

Принципы биохимической диагностики наследственных болезней менялись в процессе развития генетики человека и биохимии. Так, до 50-х годов XX в. диагностика была направлена на поиски специфичных для каждого заболевания метаболитов в моче (алкаптонурия, фенилкетонурия).
С 50-х до 70-х годов упор в диагностике был сделан на обнаружение энзимопатий. Разумеется, поиски метаболитов в конечных реакциях при этом не исключались. Наконец, с 70-х годов главным объектом диагностики стали белки разных групп. К настоящему времени все они служат предметом биохимической диагностики.

Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и др. Для этих целей используют методы качественного химического анализа, спектрофотометрические способы количественной оценки соединений, а также различные виды хроматографии.

Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена (НБО). Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относят и биологический материал.
Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), а также хромато-масс-спектрометрия (ХМС). Газовая хроматография и ВЭЖХ - универсальные методы разделения сложных смесей соединений, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляют в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для газовой хроматографии подвижной фазой служит газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксирует детектор прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что газовую хроматографию проводят, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения считают термическую неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводят в мягких условиях.

Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию об анализируемых молекулах после их преобразования в ионы.
Существенное отличие масс-спектрометрии от других физико-химических аналитических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяют непосредственно массу молекул и их фрагментов. Результаты представляют графически (так называемый масс-спектр). Иногда невозможно анализировать сложные многокомпонентные смеси молекул без их предварительного разделения. Это можно сделать либо хроматографически (жидкостная или газовая хроматография), либо использовать два последовательно соединенных массспектрометра (тандемная масс-спектрометрия - ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом для проведения анализа длительная подготовка проб не требуется (как, например, для газовой хроматографии), а время исследования занимает несколько секунд.

ТМС - одно из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО, поскольку позволяет количественно и в микроколичествах биологического материала определять множество метаболитов. В настоящее время в некоторых странах ТМС применяют для массового скрининга новорожденных на наследственные болезни.

В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, в их использовании должна быть определенная система. У пробанда или члена его семьи нереально исключить все наследственные болезни, которые могут попасть в поле зрения при обследовании пациента. Если применять максимально возможное число методов диагностики, то каждое обследование станет очень трудоемким и долгим. Исходную схему обследования строят на клинической картине болезни, генеалогических сведениях и биохимической стратегии, которые позволяют определить ход обследования на основе поэтапного исключения определенных классов наследственных болезней обмена (просеивающий метод).

Необходимо подчеркнуть, что, в отличие от цитогенетических и молекулярногенетических исследований, биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Материалом для биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты) и биоптаты мышц. При использовании просеивающего метода в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из них может быть по-разному «нагружен» реакциями в зависимости от возможностей лаборатории.

Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы обнаружить здоровых людей и отобрать пациентов для последующего уточнения диагноза. В программах первичной диагностики в качестве материала используют мочу и небольшое количество крови. Программы могут быть массовыми и селективными.

Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни. Фактически они должны функционировать в каждой большой больнице. Показания для их применения достаточно широкие, а стоимость каждого анализа невысока.

В селективных программах можно использовать простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для диагностики фенилкетонурии или с динитрофенилгидразином для обнаружения кетокислот) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Газовую хроматографию применяют для диагностики НБО органических кислот и ряда аминоацидопатий. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируют заболевания из группы гемоглобинопатий.

Нередко приходится углублять биохимический анализ от количественного определения метаболита до измерения активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью спектрофлюориметрии или спектрометрии (в зависимости от применяемого субстрата). Следует отметить, что определение активности ферментов при наследственных заболеваниях - не рутинная процедура, проводимая только в специализированных лабораториях. В современных условиях очень многие этапы биохимической диагностики выполняют автоматически, в частности с помощью аминоанализаторов.

Селективные диагностические программы обеспечивают только предположительное обнаружение больных с НБО. Методы подтверждающей диагностики включают количественное определение метаболитов, исследование их кинетики, энзимо- и ДНК-диагностику.

Показания для применения биохимических методов диагностики у новорожденных: нарушения сознания, судороги, нарушения ритма дыхания, мышечная гипотония, нарушения вскармливания, желтуха, специфический запах мочи и пота, метаболический ацидоз с дефицитом оснований и гипогликемия. У детей более старшего возраста биохимические методы используют во всех случаях подозрения на НБО (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, увеличение размеров внутренних органов), а также при клинической картине, специфичной для определенного заболевания.

Биохимические методы применяют для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность α1-антитрипсина, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.). При диагностике многих болезней биохимические методы заменяют молекулярно-генетическими в связи с их большей точностью или экономичностью. Принципиально важным считают правильное сочетание тех и других методов.

В отличие от цитогенетического метода, который позволяет изучать структуру хромосом и кариотипа в норме и диагностировать наследственные болезни, связанные с изменением их числа и нарушением организации, наследственные заболевания, обусловленные генными мутациями, а также полиморфизм по нормальным первичным продуктам генов изучают с помощью биохимических методов.

Впервые эти методы стали применять для диагностики генных болезней еще в начале XX в. В последние 30 лет их широко используют в поиске новых форм мутантных аллелей. С их помощью описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Для многих из них выявлен дефект первичного генного продукта. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектностью ферментов, структурных, транспортных или иных белков.

Дефекты структурных и циркулирующих белков выявляются при изучении их строения. Так, в 60-х гг. XX в. был завершен анализ (3-глобино-вой цепи гемоглобина, состоящей из 146 аминокислотных остатков. Установлено большое разнообразие гемоглобинов у человека, связанное с изменением структуры его пептидных цепей, что нередко является причиной развития заболеваний (см. § 4.1).

Дефекты ферментов устанавливают путем определения содержания в крови и моче продуктов метаболизма, являющихся результатом функционирования данного белка. Дефицит конечного продукта, сопровождающийся накоплением промежуточных и побочных продуктов нарушенного метаболизма, свидетельствует о дефекте фермента или его дефиците в организме (см. § 4.1).

Биохимическую диагностику наследственных нарушений обмена проводят в два этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором -более точными и сложными методами уточняют диагноз заболевания. Применение биохимических исследований для диагностики заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия, как, например, в случае фенилкетонурии.

Для определения содержания в крови, моче или амниотической жидкости промежуточных, побочных и конечных продуктов обмена кроме качественных реакций со специфическими реактивами на определенные вещества используют хроматографические методы исследования аминокислот и других соединений.